用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞生产病毒的方法技术

本发明专利技术涉及一种用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞生产病毒的方法。将培养系统和经预处理的微载体清洗、灭菌后，注入细胞培养基浸泡微载体适当时间；接种，让细胞在微载体上贴壁，让培养基循环、充氧，废弃部分培养基同时补充新鲜培养基，进行细胞培养过程。更换病毒培养基，接入种毒；让病毒在细胞上吸附完全；让培养基循环，适时将磁稳定流化床培养基出口流出的液体切换至收获液出口至收获液储罐，连续或分批收获病毒。用本发明专利技术培养Ｖｅｒｏ细胞生产乙脑病毒，细胞密度达到１０↑［８］个细胞／ｍｌ以上，病毒滴度达到８．５ＴＣＩＤ↓［５０］。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物细胞培养技术，特别是涉及一种。动物细胞大规模培养在现代生物技术及医药产业中具有越来越重要的意义，已用于生产乙肝、乙脑、狂犬等病毒进而制备疫苗。磁稳定流化床(Magnetically stabilized fluidized bed)是给普通流化床加上磁场，流化床中的颗粒也有磁性。颗粒在磁场中形成链，液体通过流化床时颗粒层均匀膨胀，液体呈活塞流动。磁稳定流化床既有普通流化床的压降和流化特性，又有填充床的液体流动和固液接触特性。此外，通过调节磁场强度，可以调节磁稳定流化床的液体流速上限，因而磁稳定流化床操作范围宽、适应面广。磁稳定流化床中固体颗粒相对静止，消除了颗粒间的碰撞和摩擦，同时磁稳定流化床中的颗粒密度可达40％(体积分率)以上，仅略低于填充床，比用于动物细胞培养的气升式反应器高1-2个数量级。因此，如果将微载体做成磁性颗粒，用磁稳定流化床培养动物细胞，有望将细胞密度提高1-2个数量级，从而提高反应器生产病毒的能力。磁稳定流化床由于具有独特的优点，已在生化工程中得到了多方面的应用。在固定化生物反应器方面，正如文献《生物技术与生物工程》(Biotech.Bioeng.1981,23,2561-2567)一文所述的将脲酶与四氧化三铁颗粒共包埋于聚甲基丙烯酸甲酯中，在外加磁场作用下，液体流速达24厘米/分钟而颗粒层仍保持稳定，同期转化率可与填充床相比。文献《化工学报》1988(1),120-126所述的以含磁粉的聚甲基丙烯酸甲酯为载体，包埋热带假丝酵母，在恒定磁场中用于含酚废水的处理，提高了反应速度，使单位体积反应器的降解量明显增加。文献《生物技术进展》(Biotech.Prog.,1990,6,452-457)所述的将磁稳定流化床应用于固定化植物细胞的培养，将细胞与磁粉共包埋制成磁性颗粒，生产次生代谢物，以培养基为流化基质，培养基循环充氧，消除了因颗粒碰撞造成的损失。而对用磁稳定流化床培养动物细胞生产病毒至今未见报道。本专利技术的目的在于克服运用微载体培养动物细胞生产病毒时，微载体颗粒在反应器中的互相碰撞，提高微载体的装填密度，减少细胞的损伤，提高动物细胞培养的密度进而提高反应器生产病毒的效率，提供一种。本专利技术的目的是这样实现的在普通的液固流化床中加上纵向磁场，流化床内装有磁敏性微载体。细胞培养基或病毒培养基从下端进入流化床，从上端离开；离开的培养基可以经过充氧后全部返回入口，实现批式培养；也可以部分返回或不返回，以实现灌注培养。磁场用Helmholtz线圈实现，线圈内通直流电。磁场方向包括向上和向下，磁场可以是均匀磁场，也可以是有梯度的自上而下增强的磁场。床体下端有滤网，以防止颗粒泄露；滤网下有支撑板；支撑板下有液体分布板，使液体均匀分布；床体下端为锥形底，以消除流化床的死角，该锥角为40°-120°；滤网、分布板和支撑板的材质以能蒸汽灭菌且不污染培养液为准，如陶瓷或不锈钢。床体上端面有接种口。床体上端有颗粒入口，用以加入磁敏性微载体颗粒。床体上端面或侧壁有开孔，用来安装传感器(如测定温度、溶液酸碱度的pH值范围、溶解氧范围)。床体上下端有灭菌蒸汽的出入口。本专利技术所如下(1)在磁场关闭的状态下，清洗磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统内的所有容器、管路；在启动磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的控制装置之前设定细胞培养所需的溶液pH值范围、溶解氧范围及反应温度。(2)将磁敏性微载体预处理后由微载体加入口加入到磁稳定流化床中，然后由灭菌蒸汽入口向系统内通入蒸汽灭菌，或在通入蒸汽前加入缓冲液至浸没磁敏性微载体再通入蒸汽灭菌；所述的缓冲液为磷酸缓冲液。或将磁敏性微载体单独灭菌后在无菌环境下加入到已经灭菌的磁稳定流化床中；其中磁敏性微载体的加入量按视体积计为磁稳定流化床工作体积的10％～95％，磁敏性微载体的矫顽力低于200安培/米，粒径为50μm～2mm，湿比重为1.1～2.5g/cm3，磁稳定流化床的液体表观流速为5厘米/分钟～25厘米/分钟，磁场强度为3～100mT；灭菌时遵循一定的次序，保证所有容器、管路、元件及微载体都充分灭菌。(3)冷却后将磁稳定流化床内的液体由排水口排出；经过微孔滤膜由磁稳定流化床培养基入口向磁稳定流化床内注入细胞培养基至浸没磁敏性微载体但不超过磁稳定流化床的工作体积的95％，浸泡磁敏性微载体适当时间。(4)由磁稳定流化床的接种口加入已制备好的细胞种子液。(5)经过气体过滤装置由磁稳定流化床的灭菌蒸汽入口通入能使磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气，持续5秒钟以上，使磁敏性微载体颗粒悬浮并与液体充分混合，然后开启磁场，停止通气，20-30分钟后关闭磁场——通气——开启磁场——停止通气；以后每隔20-30分钟重复关闭磁场——通气——开启磁场——停止通气的过程，直至细胞在磁敏性微载体上贴壁完全；其中的通气是指前述的经过气体过滤装置通入能使磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气并持续5秒钟以上；经过微孔滤膜补足细胞培养基使之充满充氧装置和管路。(6)启动磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的控制装置和充氧装置，让细胞培养基循环，进行细胞培养过程；根据实际操作的需要，经过微孔滤膜连续或分批补充新鲜细胞培养基，定时取样分析，直至达到所需的细胞密度或预定的培养时间；关闭磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的控制装置和充氧装置，停止细胞培养基的循环；在细胞培养过程中，每隔2-12小时将磁场关闭一下，再重新开启。(7)将磁稳定流化床培养系统中的细胞培养基排出，经过微孔滤膜由培养基入口加入洗涤液至充满培养系统，用洗涤液浸泡培养系统或使洗涤液在培养系统中循环一定时间，对磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统进行洗涤，然后排出洗涤液；根据培养过程的需要决定洗涤液的配方和洗涤次数1-5次或更多次；设定病毒培养过程所需的溶液pH值范围、溶解氧范围、反应温度；经过微孔滤膜加入病毒培养基至浸没贴有细胞的磁敏性微载体但不超过磁稳定流化床的工作体积的95％；启动磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的温度控制装置，接入种毒；关闭磁场，经过气体过滤装置由磁稳定流化床的灭菌蒸汽入口通入能使贴有细胞的磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气，持续5秒钟以上，使贴有细胞的磁敏性微载体颗粒悬浮并与液体充分混合，然后开启磁场，停止通气，20-30分钟后关闭磁场——通气——开启磁场——停止通气；以后每隔20-30分钟重复关闭磁场——通气——开启磁场——停止通气的过程，直至病毒在细胞上吸附完全；其中的通气是指前述的经过气体过滤装置通入能使贴有细胞的磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气并持续5秒钟以上；经过微孔滤膜补足病毒培养基使之充满充氧装置和管路；启动磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的溶解氧控制装置、pH控制装置和充氧装置，让病毒培养基循环；适时将磁稳定流化床培养基出口流出的液体切换至收获液出口至收获液储罐，连续或分批收获病毒，并同时经过微孔滤膜补充病毒培养基，直至病毒收获结束；关闭相应的管路。(8)经过微孔滤膜由磁稳定流化床培养基入口泵入无菌水将磁稳定流化床内的残液由上端收获液出口顶出至收获液储罐，或由下端的培养基入口将残液直接放至收获液储罐，或将残液由排水口排出；关闭磁场，向系统内通入蒸汽灭菌；将贴有细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞生产病毒的方法，其特征在于该方法的步骤为：（１）在磁场关闭的状态下，清洗磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统内的所有容器、管路；在启动磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的控制装置之前设定细胞培养所需 的溶液ｐＨ值范围、溶解氧范围及反应温度；（２）将磁敏性微载体预处理后由微载体加入口加入到磁稳定流化床中，然后由灭菌蒸汽入口向系统内通入蒸汽灭菌；或在通入蒸汽前加入缓冲液至浸没磁敏性微载体再通入蒸汽灭菌，所述的缓冲液为磷酸缓冲液；或将磁敏 性微载体单独灭菌后在无菌环境下加入到已经灭菌的磁稳定流化床中；其中磁敏性微载体的加入量按视体积计为磁稳定流化床工作体积的１０％～９５％，磁敏性微载体的矫顽力低于２００安培／米，粒径为５０μｍ～２ｍｍ，湿比重为１．１～２．５ｇ／ｃｍ↑［３］，磁稳定流化床的液体表观流速为５厘米／分钟～２５厘米／分钟，磁场强度为３～１００ｍＴ；（３）冷却后将磁稳定流化床内的液体由排水口排出；经过微孔滤膜由磁稳定流化床培养基入口向磁稳定流化床内注入细胞培养基至浸没磁敏性微载体但不超过磁稳定流化床 的工作体积的９５％，浸泡磁敏性微载体适当时间；（４）由磁稳定流化床的接种口加入已制备好的细胞种子液；（５）经过气体过滤装置由磁稳定流化床的灭菌蒸汽入口通入能使磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气，持续５秒钟以上，使磁敏性微载体颗粒悬 浮并与液体充分混合，然后开启磁场，停止通气，２０－３０分钟后关闭磁场－通气－开启磁场－停止通气；以后每隔２０－３０分钟重复关闭磁场－通气－开启磁场－停止通气的过程，直至细胞在磁敏性微载体上贴壁完全；其中的通气是指前述的经过气体过滤装置通入能使磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气并持续５秒钟以上；经过微孔滤膜补足细胞培养基使之充满充氧装置和管路；（６）启动磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的控制装置和充氧装置，让细胞培养基循环，进行细胞培养过程；根据实际操作的需要，经过微孔 滤膜连续或分批补充新鲜细胞培养基，定时取样分析，直至达到所需的细胞密度或预定的培养时间；关闭磁稳定流化床动物细胞和病毒培养系统的控制装置和充氧装置，停止细胞培养基的循环；在细胞培养过程中，每隔２－１２小时将磁场关闭一下，再重新开启；（７ ）将磁稳定流化床培养系统中的细胞培养基排出，经过微孔滤膜由培养基入口加入洗涤液至充满培养系统，用洗涤液浸泡培养系统或使洗涤液在...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丛威，吕秀菊，高红亮，欧阳藩，
申请(专利权)人：中国科学院化工冶金研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]