番茄花叶病毒弱毒疫苗K基因组的两个致弱突变及用途制造技术

本发明专利技术涉及植物病毒基因工程领域。通过点突变的方式把分离和克隆的番茄花叶病毒强株基因组改造为弱毒疫苗Ｋ基因组，其编码复制酶和运动蛋白的核苷酸序列具有乳石突变和赭石突变，可以做为模式进行植物病毒基因组的改造，制备基因工程疫苗，有效地用于植物病毒病的防治。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物病毒基因工程领域，特别是涉及烟草花叶病毒属的一株番茄花叶病毒弱毒疫苗基因组的全序列以及弱化的突变方式。植物病毒弱毒疫苗在防治植物病毒病害中发挥着重要的作用，能够在植物体内生存和繁殖，却不危害植物的正常生长、开花和种子生产，而对攻击病毒侵染植物具有防御作用，这种共生和保护宿主的现象是大多数植物弱病毒所具有的共同特征，具有普遍性。Kunkel、Grant、Posnett和Todd曾先后提出利用植物天然弱病毒分离物预防强病毒侵染的设想，并在果树病毒研究中曾以自然界分离的弱病毒作了保护试验。但由于这些果树病毒不容易深入分析其保护作用和进一步研究，后来又转入草本植物病毒的人工诱变弱毒疫苗的研究。大岛信行等利用高温诱变获得L11系列番茄花叶病毒疫苗，在生产实践中得到广泛应用，80年代后对其进行了分子生物学的研究，对三个克隆的病毒基因组测序发现病毒基因组核苷酸不一致，因而未能得到进一步的研究。Rast曾用亚硝酸诱变得到M-Ⅱ-16弱毒分离物，由于这个分离物还引起花叶症状和遗传性不够稳定，未在生产上应用。八十年代，人们展开了对弱病毒致弱与交叉保护机理的分子生物学研究，Banerjee发现烟草花叶病毒(TMV)普通株(U1)突变体YSI/1致弱的原因是病毒外壳蛋白基因在5770和6127位点的突变使Val→Asp和Phe→Ser；Nishiguchi认为TMV弱毒疫苗L11和L11A(番茄株)的致弱是由于126kDa复制酶3个氨基酸的突变造成；Shiian对TMV弱毒疫苗V-69(番茄株)54％的基因组分析，发现6个碱基的突变引起了编码蛋白氨基酸的变化，但其中那几个碱基的突变起关键作用，却不清楚，由此可见，植物病毒致弱的分子机理尚无定论。八十年代初，曾报道过用亚硝酸处理番茄花叶病毒强株而获得了弱毒疫苗，可以防治烟草和番茄免受大多数烟草花叶病毒属成员的侵染，在温室和大田使用具有明显的增产效果，而且遗传性稳定。对其理化性质、感病组织中双链RNA的变化情况和免疫蛋白以及RNA体外翻译产物等进行了研究，然而皆无其弱化机理的明确报导。为进一步揭示番茄花叶病毒弱毒疫苗(以下简称K)致弱的分子机理，通过反转录、PCR、克隆、体外转录和烟草感染获得了侵染性cDNA(infectiouscDNA)克隆pK；测定和分析了其基因组核苷酸全序列，与番茄花叶病毒强株(日本分离物)相比，发现K基因组中复制酶和运动蛋白分别发生了乳石和赭石突变；在普通株和K之间用基因交换法构建了K的重组病毒，体外转录和侵染性分析表明K突变的复制酶和运动蛋白对该病毒的致弱分别起主要和次要作用；用点突变的方法分别研究了普通株和K的3个突变体对烟草的侵染性，并分析了转复制酶和运动蛋白基因植物对部分烟草花叶病毒属成员的交叉保护作用，这些结果均表明K基因组的这种突变是其致弱和交叉保护的根本原因。K基因组的这种突变方式是目前在植物病毒中发现的特有现象，本专利技术的意义在于利用这种突变所造成的病毒弱化作用模式将为其他植物病毒(主要是RNA病毒)基因组的改造和基因工程疫苗的研制提供了广阔的应用前景，对植物病毒病的全面防治将起着重要的作用。具体的说本专利技术可应用于1．烟草花叶病毒属成员以及其他植物病毒基因组的改造以研制或生产弱毒疫苗或基因工程疫苗，防治植物病毒病。2．可用于不影响植物的正常生长与繁殖而在相应易感植物中表达外源基因的载体。3．可用于不对接种植物产生严重危害而在病毒粒子表面展示外源肽段的展示载体。实施本专利技术可以达到如下有益效果1．K基因组的突变方式以复制酶基因组在2670-2672的UGA无义突变和运动蛋白基因组在5632-5634的UAA无义突变为特征，这种突变是目前在植物病毒弱毒株系中发现的特有现象。含有这类突变的病毒会致弱植物病毒的侵染，因而能够用于植物病毒的交叉保护。而K致弱的突变方式可用于与K有类似基因组形式的其它植物病毒，特别是正链RNA病毒，如虹豆花叶病毒科(Comoviridae)，马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，线形病毒属(Capillovirus)，香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，长线形病毒属(Closterovirus)，黄症病毒属(Luteovirus)，玉米褪绿斑驳病毒属(Machomovirus)，坏死病毒属(Necrovirus)，马铃薯X病毒属(Potexvirus)，南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)，烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的其它成员，毛病毒属(Trichovirus)，芜菁花叶病毒属(Tymovirus)。2．目前，TMV作为载体已应用于某些外源基因在植物(尤其是烟草)中的表达，其主要方法是将外源基因替代病毒基因组的CP编码区，转录后接种植物，同时接种缺损病毒(如仅含有病毒基因组的复制酶与外壳蛋白)，这样利用辅助病毒的CP来包装嵌合有外源基因的重组病毒基因组，而使外源基因得到表达；另一种方法是在转CP基因的植物上，接种上述嵌合体的转录产物，利用在植物中表达的CP来包装嵌合病毒，从而表达外源基因。这两种方法都会形成重组强病毒而扩散，对被接种植物具有严重的损伤，在田间使用必然会危害其他植物。而K作为弱毒疫苗，其本身就具有抗病毒的作用，以K的基因组作为载体进行外源基因的表达就不会出现上述问题。该病毒的潜在作用还在于针对相应植物可以携带使该植物得到免疫或生长的外源基因。3．用于外源肽段在病毒颗粒表面的展示时，也存在上述的优点。实现本专利技术的技术方案步骤如下将番茄花叶病毒强株(L-TMV)用亚硝酸诱变处理后，用枯斑寄主(心叶烟或枯斑三生烟)获得的单斑，接种普通烟(黄苗榆品种)或番茄(加八品种)。每次挖取几十个单斑，淘汰所有在普通烟和番茄上表现症状的单斑分离物，将不表现症状的单斑分离物回接心叶烟或枯斑三生烟，检查病毒的存在；选取不表现症状而有病毒增殖的单斑分离物，连续进行单斑分离和毒力鉴定3-4次，以获得稳定遗传的弱毒株系。如上所述，K是用亚硝酸诱变番茄花叶病毒强株后筛选获得的，这种诱变是随机的，但本专利技术所获得的突变体却具有稳定的遗传性，虽然再用亚硝酸处理番茄花叶病毒强株不一定能得到与K基因组完全相同的突变体，但可用点突变的方式对自然条件下分离和克隆的番茄花叶病毒强株基因组进行改造而获得，并通过体外转录和烟草侵染试验获得稳定遗传的基因工程弱毒疫苗。实施例1．点突变使番茄花叶病毒基因组cDNA复制酶编码基因在2670-2672核苷酸形成乳石突变(TGA)，运动蛋白编码基因在5632-5634核苷酸形成赭石突变(TAA)。点突变可用PCR(聚合酶链反应)，将突变位点引入到引物中。其方法如下(1)突变引物设计上下游(5′和3′)引物必须包括突变位点，而且在退火后二者完全配对形成双链；复制酶5′突变引物序列为5′-GATGATCAGATGAAGAGCTAATG-3′,3′突变引物5′-CATTAGCTCTTCATCTGATCATC-3′。运动蛋白5′突变引物5′-AGTTTAAAAAGA GTTTAATAATTTGATTAAAGATTAAGC-3′,3′引物5′-GCTTAATCTTTAATCAAATT ATTAAACTCTTTTTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
番茄花叶病毒弱毒疫苗基因组，其特征在于番茄花叶病毒弱毒疫苗Ｋ基因组中，编码复制酶和运动蛋白的核苷酸序列具有乳石突变和赭石突变，该突变具有致弱植物病毒的功能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邱并生，杨恭，田波，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]