结缔组织生长因子(CTGF)及应用方法技术

本发明专利技术提供了大鼠结缔组织生长因子（ＣＴＧＦ），生产ＣＴＧＦ的方法和采用ＣＴＧＦ或其衍生物的治疗方法。本发明专利技术进一步提供了调节ＣＴＧＦ活性和缓解与ＣＴＧＦ相关的细胞增殖性疾病的方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术广义上涉及了生长因子的领域，更具体地说，涉及结缔组织生长因子(CTGF)和调节CTGFs活性的方法。生长因子在发育组织中刺激靶细胞增殖、分化和成为组织。生长因子的作用有赖于它们与特异性受体的结合，该特异性受体在细胞内刺激了信号的发生。生长因子的实例包括血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I，IGF-II)、转化生长因子β(TGF-β)、转化生长因子α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)和已知刺激细胞增殖的结缔组织生长因子(CTGF)。PDGF是在循环血小板的α颗粒中发现的一个阳离子、热稳定蛋白质，已知是结缔组织细胞如成纤维细胞和平滑肌细胞的一个促分裂素和化学趋化剂。由于该分子的活性，PDGF被认为是参与伤口正常愈合和在病理学上对如动脉粥样硬化和纤维化等病变起作用的一个主要因子。PDGF是由α和/或β链联合组成的二聚体分子。这些链形成异型二聚体或同型二聚体，目前分离的所有这些联合体都是具有生物活性的。对各种生长因子在组织再生和修复中作用的研究发现了PDGF样蛋白质。这些蛋白质具有与PDGF相似的免疫学和生物学活性，并能被PDGF特异的抗体所阻断。多肽生长因子和细胞因子是作为一种重要类型的子宫蛋白质出现的，这些蛋白质可以在母体子宫和发育中的胚胎或胎儿之间形成生长信号通路。不同物种的研究提示EGF、结缔组织EGF样生长因子(HB-EGF)、IGF-I、IGF-II、aFGF、bFGF、pleitrophin(PTN)、白血病抑制因子、集落刺激因子-1(CSF-1)和TGF-α可能是参与这些过程的子宫生长调节分子中的成员。CTGF是一个相对分子量(Mr)为38,000的富含半胱氨酸的单体肽，它是一个对结缔组织细胞有促分裂和化学趋化活性的生长因子。CTGF由细胞分泌，在与特异性细胞表面受体的相互作用中是有活性的。CTGF是与PDGF的α或β链基因不相关的一个基因的产物。它是一个生长调节因子家族的成员，该调节因子家族包括鼠(也被称为fisp-12或βIG-M2)和人CTGF、Cyr61(鼠)、Cef10(鸡)和Nov(鸡)。在序列比较的基础上，发现这些家族成员均有模式化结构，包括(1)一个负责结合的胰岛素样生长因子区，(2)一个负责复合体形成的冯威勒布兰特(VonWillebrand)因子区，(3)一个可能负责结合基质分子的血小板反应蛋白I型重复片段，和(4)一个在基质蛋白中发现的C-末端结构，推测负责受体的结合。人CTGF(hCTGF)的cDNA序列包含一个1047个核苷酸的开放阅读结构，其起始位点在130位，TGA末端位点在1177位，并编码一个349个氨基酸的肽。在CTGF的cDNA和PDGF的α或β链的cDNA之间仅有40％的序列同源性。hCTGF开放阅读结构编码一个含39个半胱氨酸残基的多肽，表明是一个具有多个分子内二硫键的蛋白。肽的氨基末端含有一个代表分泌蛋白的疏水信号序列，在氨基酸序列的天冬酰胺残基28和225位有两个N-连接的糖基化位点。在CTGF多肽和由CEF-10mRNA转录体编码的多肽之间总体有45％的序列同源性；当推定的可选择剪接区被去掉时同源性达到52％。如果有如何肽序列一致，CTGF在抗原性上与PDGF相关，尽管相关很少。抗PDGF抗体与PDGF或CTGF的非还原形式具有较高的亲和力，而与缺乏生物活性的这些肽的还原形式的亲和力小10倍。这表明在PDGF异构体和CTGF分子之间有共同的三级结构区，导致了共同的抗原决定簇。CTGF的合成和分泌可选择性地由TGF-β、BMP-2和可能的TGF-β蛋白超家族的其他成员诱导。虽然TGF-β在琼脂糖中可刺激正常成纤维细胞的生长，但CTGF单独不能在成纤维细胞中诱导这种特性。然而，CTGF的合成和作用已显示对于TGF-β刺激不依赖成纤维细胞生长的固着是必需的。CTGF或其片段，可能在创伤愈合中作为一个生长因子起作用。在病理学上，CTGF被推测与结缔组织细胞过度生长的病理状态，如全身性硬化、癌症、纤维化病变和动脉粥样硬化有关。CTGF多肽的基本生物活性是其促细胞分裂性，或刺激靶细胞增殖的能力和其在细胞外基质合成中的作用。在体内这种促分裂活性的最终结果是靶组织的生长。CTGF也具有化学趋化活性，即细胞与特定分子相互作用从而化学性诱导运动。专利技术概述本专利技术提供了一个多核苷酸和及其编码的多肽，该多肽已被鉴定为大鼠结缔组织生长因子(CTGF)。根据本专利技术的一个方面，提供了一个新的重组CTGF，及其活性片断、类似物和衍生物。根据本专利技术的另一个方面，提供了编码本专利技术的CTGF的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA，以及蛋白质的活性类似物和片断。在另一个方面，本专利技术提供了通过重组技术生产CTGF多肽的方法，该法包括在促进蛋白质表达和随后回收该蛋白质的条件下，培养含有编码本专利技术蛋白质的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。本专利技术另一方面提供了与CTGFs结合的抗体。在另一方面，本专利技术提供了在细胞内抑制CTGF表达的多核苷酸，包括一个在细胞中与CTGF靶核酸序列互补的连续核苷酸序列，其中在细胞中多核苷酸与CTGF靶核酸序列杂交，从而与CTGF表达的未抑制水平相比，抑制了CTGF的表达，。本专利技术进一步提供了一种抑制细胞中CTGF表达的方法，包括用含有在细胞中与CTGF靶核酸序列互补的连续核苷酸序列的多核苷酸与细胞接触，其中多核苷酸抑制细胞中CTGF的表达。而根据本专利技术的再一方面，提供了一种在个体中抑制CTGF表达的方法，包括给予患者含有在细胞中与CTGF靶核酸序列互补的连续核苷酸序列的多核苷酸，多核苷酸以足以抑制患者中CTGF表达的水平表达。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种治疗与CTGF相关疾患的药物组合物。该药物组合物包括一个药学可接受的载体和治疗有效剂量的与CTGF核酸结合的寡核苷酸。附图的简要说明下列附图是本专利技术实施方案的举例图示，并不意味限制如权利要求中所包括的本专利技术的范围。附图说明图1显示了大鼠CTGF克隆2-4-7的核酸序列和由此核酸序列编码的氨基酸序列。图2显示了大鼠(rCTGF)(SEQ ID NO2)、人(hCTGF)(SEQ ID NO3)和鼠(mCTGF)(SEQ ID NO4)CTGF多肽的氨基酸序列比较。图3显示了用反义寡聚体处理后CTGF mRNA表达的Northem印迹(Northern blot)分析。Northem印迹结果表明靶向CTGF的6个反义寡聚体均导致靶mRNA的断裂。稳定的CTGF5’裂解片断(箭头所指)在印迹上清晰可见(图3，板A)。作为上样和转移有效性的内参照，印迹用放射性标记的鼠GAPDH片断进行探测(图3，板B)。从下面的详细描述中将显现本专利技术的其它目的、特征和优点。但可以理解的是，详细的描述和具体的实例，在说明本专利技术的优选实施方案时，仅仅以举例的方式给出，因为从这一详细的描述中，本领域的专业技术人员可明白在本专利技术的构思和范围内的各种变化和改进。本专利技术的详细描述本专利技术公开了大鼠结缔组织生长因子(CTGF)的核酸序列及其编码的蛋白质。这个蛋白质可能在哺乳类动物组织的正常发育、生长和修复中起重要本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２中列出的氨基酸序列或其功能片段的基本上纯的ＣＴＧＦ多肽。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：BF施密特，ML阿伦，F斯韦德鲁普，DF卡迈克尔，
申请(专利权)人：法布罗根公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]