乳头瘤假病毒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种能通过口服途径产生免疫反应的乳头瘤假病毒及其制备方法。其特点，是将人乳头瘤病毒样颗粒（ＨＰＶ－ＶＬＰ）或牛乳头瘤病毒样颗粒（ＢＰＶ－ＶＬＰ），解离，掺入质粒（ｐｌａｓｍｉｄｓ或ＤＮＡ疫苗），从新组合成人或牛乳头瘤假病毒，通过口服送入人体的粘膜和系统性淋巴组织，激活人体的免疫反应，起到防病治病的作用，此假病毒可以诱导出比基因疫苗更强的免疫反应。之外，此假病毒可以将基因送到体内淋巴组织，可以用于基因治疗。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种能通过口服途径产生免疫反应的。此假病毒可以用于疫苗来预防和治疗粘膜致病菌感染或粘膜肿瘤，此假病毒也可用于基因治疗。我们都知道病原微生物和人体免疫机能缺陷是导致许多疾病的根源，人体经常遭受病原微生物的侵袭及人体内部暗藏的肿瘤的破坏。因此，人体也需要一种机体抵抗力或免役力来抵抗病原微生物的入侵感染和机体内部的病变。目前临床使用的疫苗是通过皮下或肌肉注射，从而产生特异的免疫反应，导致对这种疾病的抵抗能力，使以后不再得这种病。但是，这些疫苗往往是皮下或肌肉注入人体后，只能产生系统性免疫反应，而不能产生粘膜免疫反应。这样的疫苗往往不能预防和治疗粘膜传染的致病菌。但是，许多致病菌是由粘膜传染的，比如艾兹病。本专利技术的目的就是研究出一种不会致病的类似病毒的假病毒，将用于治疗和预防疾病的基因或DNA疫苗注入此病毒外壳内，通过口服的途径送入人体的粘膜和系统性淋巴组织，激活人体的免疫反应，起到防病治病的作用。本专利技术所说的乳头瘤假病毒是将人乳头瘤病毒样颗粒(HPV-VLP)或牛乳头瘤病毒样颗粒(BPV-VLP)，解离，掺入质粒(plasmids)，从新组合成人或牛乳头瘤假病毒。正常病毒是由一个外壳和壳内的DNA构成，而专利技术所说的这个乳头瘤假病毒只有一个病毒的外壳，而无壳内的病毒的DNA。如果将DNA疫苗放入这个病毒外壳内，就可以通过口服送入人体内。本专利技术所述的DNA疫苗只是一段DNA片段，不是病毒的DNA，若把这个DAN片段皮下或肌肉注射人体内，就可以诱导系统免疫反应，因此含有DNA疫苗的病毒外壳就是本专利技术所述的假病毒。此假病毒的制备方法如下(1)将乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液混合，体积混合比为1∶1，培养60min，室温；解离缓冲液EGTA 20mM、DTT 40mM、NaCl 300mM、Tris-HCL(PH8.0)100mM；(2)加入1/10体积的质粒，0.5-1μg/μl；(3)逐步加入终止缓冲液，终止缓冲液Cacl225mM，DMSO20％(体积百分比)(4)将混合液放在4℃过夜。此假病毒不致病，可用于基因治疗，即将所要表达的基因插入质粒，装入病毒样颗粒，此假病毒即可将此基因经口服送入肠粘膜及系统淋巴组织，还有粘膜上皮组织。更重要的是此假病毒可以用作疫苗，将抗原的基因装入质粒，然后合成假病毒，经口服，可产生保护性的免疫反映。这一点与其他疫苗不同，是因为许多疫苗只能皮下或肌肉注射而不能口服。只能产生系统性免疫反应但不能产生粘膜免疫反应。因为许多致病菌是通过粘膜传染，所以只有此假病毒才可能产生有效的免疫反应来防止或治疗粘膜的致病菌的感染。这些致病菌包括细菌，比如沙门氏菌等。还有病毒，比如HIV(人免疫缺陷病毒)等。同时此病毒还可以用于诱导抗肿瘤免疫反应来治疗肿瘤，特别是粘膜肿瘤，比如结肠肿瘤。假病毒能诱导比基因疫苗更强的免疫反应。实例1首先将人乳头瘤病毒的外壳与解离缓冲液按1∶1体积混合、培养60min，室温，解离缓冲液为EGTA 20mM，DTT 40mM，NaCl300mM，Tris-HCL(PH8.0)100mM，然后加入1/10体积的0.5μg/μl的pCI-GLP-LCMV质粒，再将终止缓冲液逐步加入，终止缓冲液为CaCl225mM，DMSO 20％体积百分比，将混合好的混合液放在4℃过夜。用假病毒对C57BL6小鼠做免疫试验，用皮下注射方式注入小鼠体内，同时也将此种质粒直接注入其他小鼠的体内与其作对比试验，用Cr51释放试验，或r干扰素分泌试验(Elispot)。测出假病毒可以诱导出比质粒诱导出更多的特异性细胞毒细胞。因此在诱导细胞免疫反应上，假病毒疫苗比基因疫苗效用高。实例2首先将牛乳头瘤病毒的外壳与解离缓冲液按1∶1体积混合、培养60min，室温，解离缓冲液为EGTA 20mM，DTT 40mM，NaCl300mM，Tris-HCL(PH8.0)100mM，然后加入1/10体积的1.0μg/μl的携带绿色荧光蛋白GLP的基因的质粒，再将终止缓冲液逐步加入，终止缓冲液为CaCl225mM，DMSO 20％体积百分比，将混合好的混合液放在4℃过夜。用此假病毒让小鼠口服(使用胃管)，然后检测GLP的表达。我们可以在肠粘膜、肠粘膜淋巴结，脾脏检测出GLP此假病毒可以携带基因到粘膜及系统淋巴系统。因此，可以用于基因治疗。若用质粒本身口服则测不到GLP。实例3用与实例1同样的方法制备含有HPV16E7质粒的假病毒经口服来免疫动物，可诱导出粘膜及系统E7特异性的细胞毒细胞，然而直接用此质粒本身，则诱导不出免疫反应。因此此假病毒可以用于诱导粘膜及系统免疫反应。实例4用于实例1、2同样的方法制备含有HPV和BPV质粒的假病毒，然后用含有HPV的假病毒经口服免疫小鼠，然后用含有BPV的假病毒来感染小鼠，发现HPV假病毒可以防止BPV假病毒的感染。此假病毒可以用于提供免疫保护。实例5用实例1或实例2的方法制备含有白介素-II的假病毒，用于提高粘膜反应的效率。经过口服进入肠粘膜淋巴组织和其他淋巴组织，提高对粘膜免疫诱导的效率。权利要求1.一种乳头瘤假病毒，其特征在于它是由人乳头瘤病毒样颗粒或牛乳头瘤病毒样颗粒解离然后参入质粒，重新组合而成的人或牛乳头瘤假病毒。2.一种乳头瘤假病毒的制备方法，其特征在于(1)首先将人乳头瘤病毒样颗粒或牛乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液的1∶1体积混合，解离缓冲液为EGTA 20mM，DTT 40mM，NaCl2300mM，Tris-HCL(PH8.0)100mM；(2)加入1/10体积的质粒0.5-1μg/μl的质粒；(3)逐渐加入终止缓冲液，终止缓冲液为CaCl225mM，DMSO20％体积百分比；(4)混合好的混合液放在4℃过夜；3.根据权利要求2所述的一种乳头瘤假病毒的制备方法，其特征在于可将抗原基因插入质粒合成假病毒来制作疫苗；4.根据权利要求2所述的一种乳头瘤假病毒的制备方法，其特征在于可将治疗基因插入质粒合成假病毒，用于基因治疗。全文摘要本专利技术涉及一种能通过口服途径产生免疫反应的。其特点,是将人乳头瘤病毒样颗粒(HPV－VLP)或牛乳头瘤病毒样颗粒(BPV－VLP),解离,掺入质粒(plasmids或DNA疫苗),从新组合成人或牛乳头瘤假病毒,通过口服送入人体的粘膜和系统性淋巴组织,激活人体的免疫反应,起到防病治病的作用,此假病毒可以诱导出比基因疫苗更强的免疫反应。之外,此假病毒可以将基因送到体内淋巴组织,可以用于基因治疗。文档编号A61K48/00GK1333338SQ0111800公开日2002年1月30日 申请日期2001年5月15日 优先权日2001年5月15日专利技术者乔良, 石伟 申请人:乔良, 石伟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳头瘤假病毒，其特征在于：它是由人乳头瘤病毒样颗粒或牛乳头瘤病毒样颗粒解离然后参入质粒，重新组合而成的人或牛乳头瘤假病毒。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：乔良，石伟，
申请(专利权)人：乔良，石伟，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]