抗CD3免疫毒素及其治疗用途制造技术

本发明专利技术描述了重组免疫毒素多肽，其包含ＣＤ３结合域和假单胞菌外毒素突变体，尤其包含作为ＣＤ３结合部分的单链（ｓｃ）Ｆｖ。本发明专利技术的优选种类包含ｓｃＦｖ（ＵＣＨＴ－１）－ＰＥ３８。本发明专利技术还公开了该免疫毒素的制备方法；作为本发明专利技术免疫毒素制备过程中的中间物的功能等同的免疫毒素，和多核苷酸和寡核苷酸中间物；用免疫毒素或其可药用盐预防和／或治疗移植排斥，和诱导耐受，以及治疗自身免疫病和其它免疫疾病的方法；和包含该免疫毒素或其可药用盐的药物组合物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及包含CD3结合域和假单胞菌外毒素A突变体的重组免疫毒素。每个成熟T细胞表面是由α和β(或者γ和δ)多肽链的异二聚体组成的T细胞受体(TCR)分子。每个细胞上有约30000个TCRαβ异二聚体，它们与抗原呈递细胞表上(APC)的主要组织相容性复合体(MHC)衔接，导致所有功能性T细胞种类对抗原的识别。TCRαβ异二聚体本身并不涉及TCR与特定MHC-肽抗原复合体衔接后的信号传导。实际情况是，此功能是由与所有外周T细胞和成熟胸腺细胞表面的TCRαβ或TCRγδ异二聚体稳定结合的蛋白复合体即CD3复合体完成的。人CD3复合体通常包含四种不同的链γ、δ、ε和ζ，共六种多肽。三种不同的二聚体组成CD3复合体(γε、ζε和ζζ)，。CD3蛋白对细胞表面T细胞受体链的表达是绝对必要的。缺失任何TCR链或者CD3复合体的γ、ε或δ链的突变体都不能在细胞表面表达任何TCR复合体。当APC向静息的T淋巴细胞传递两种信号时，发生抗原特异性T细胞活化和克隆扩增。第一个信号给免疫反应赋予特异性，在识别在MHC环境中呈递的抗原肽后通过TCR介导。通过TCR的最适宜的信号传导需要TCR与辅助受体CD4或CD8的聚集。继而引起胞液中的酪氨酸激酶与TCR和CD3的胞浆尾端以及CD45的结合增加。CD3ε和ζ的胞浆区的磷酸化导致其与酪氨酸激酶的结合，引发一系列细胞内的反应，导致T细胞的增殖和分化。第二信号被称为“共刺激”信号，它既不是抗原特异性的也不是MHC限制性的，它由APG表达的一个或多个不同的表面分子提供的。T细胞接受抗原特异性信号和共刺激信号后活化，这可包括T细胞增殖和细胞因子分泌。抗原和共刺激信号的结合诱导原初T细胞表达IL-2和IL-2受体。IL-2诱导原初T细胞的克隆增殖，并使它的子代细胞分化成效应T细胞，效应T细胞能够合成行使辅助、炎症和细胞毒性T细胞等的特化功能所需要的所有蛋白，参见，例如Janeway和Travers，同上§§7-8，7-9。上述的获得性免疫机制是器官移植成功的主要障碍。当把包含有核细胞的组织从供体向移植物接受者移植时，接受者体内T细胞对移植物中典型的高多态性MHC分子的反应几乎总是引发T细胞介导的即刻抗移植器官的反应。有效的免疫抑制剂如环胞素A和FK-506的抑制T细胞活化的应用已使移植物的存活率明显增加，但这同时伴有某些缺点，包括移植物接受者终生对药物的依赖。寻找针对接受器官移植或患T细胞介导的免疫性疾病的患者的更好的免疫抑制方法已经成为移植领域长期的目标。此领域工作者的具体目标是开发能在患者体内诱导供体特异的免疫耐受的治疗剂，使患者摆脱对免疫抑制剂的持续依赖。术语“免疫耐受”是指受到诱发耐受的抗原攻击的患者的免疫系统的无应答状态。具体地，在移植情况下它指移植物接受者发动免疫反应的能力受到抑制，否则，移植物中非自身MHC抗原输注到接受者体内可引起免疫反应。免疫耐受的诱发涉及体液机制、细胞机制或两者兼有。在用供体细胞进行骨髓移植以前，全身或整个淋巴系统用射线照射，通过嵌合方式动物模型和人体可获得系统的供体特异性的免疫耐受。然而，迫切需要在不使用射线照射时也可产生多细胞系混合的同种异体稳定嵌合体和长时间供体特异耐受的同种异体骨髓移植的调节方法。血液异常包括地中海贫血和镰刀状细胞病、自身免疫疾病和几种类型的酶缺乏疾病已经不使用骨髓移植策略，因为建立完全同种异体骨髓重建体的调节方法可导致与此相关的某些疾病的发生。不涉及射线照射的调节方法可以很明显地扩大骨髓移植对非恶性疾病的应用范围。包含与毒素连接的抗体的免疫毒素已被推荐用于器官移植排斥的预防和治疗和免疫耐受的诱导。例如，一种直接针对恒河猴CD3ε的化学结合的白喉免疫毒素，即FN18-DT390，已经用于灵长类同种异体移植耐受模型和灵长类胰岛异种移植模型。另外，化学偶联的假单胞菌免疫毒素，LMB-1B3(Lys)-PE38，已经用于临床实验治疗严重的实体肿瘤。然而，产物异质性是化学结合的免疫毒素所面临的明显的实际困难。包含抗CD3抗体UCHT-1的可变区和白喉毒素的单链重组免疫毒素，已经推荐作为治疗剂(WO96/32137，WO98/39363)。然而，对普通人群进行的早期抗白喉接种引起人们对业已存在的抗体对许多患者体内毒素的作用的关心。另外，包含与PE38连接的抗Tac的重组免疫毒素也被推荐作为抗器官移植和自身免疫病的预防和治疗剂。人们的目标是获得对T细胞有高水平的定向毒性作用的重组免疫毒素，从而对移植排斥的预防和治疗、免疫耐受的诱导、以及移植物抗宿主疾病(GVHD)、自身免疫病和其它T细胞介导的疾病的预防和治疗提供改进。提供一种免疫毒素，在正常情况下，接受者不存在针对它的抗体，这也是人们的目标。目前，我们已发现CD3结合域和假单胞菌外毒素A突变体的重组融合提供了一种具有有效抗T细胞作用的免疫毒素。本专利技术的免疫毒素能改善对下列疾病的临床治疗和预防，这些疾病是移植物排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、T细胞介导的自身免疫病、T细胞白血病、或携带CD3表位的淋巴瘤、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)和其它T细胞介导的疾病或病症。本专利技术指向包含CD3结合域和假单胞菌外毒素A成分的分离的重组免疫毒素和它们可药用盐；用免疫毒素或它们可药用盐治疗和预防器官移植排斥和移植物抗宿主疾病、和诱导免疫耐受、以及治疗或预防自身免疫疾病、AIDS和其它T细胞介导的免疫疾病、和T细胞白血病或淋巴瘤的体内和离体方法；和包含该新的免疫毒素或它们的可药用盐的药物组合物。本专利技术也涉及作为主题重组免疫毒素制备过程中的中间物质的多核苷酸和生理功能相同的多肽；包含所述多核苷酸的重组表达载体、原核和真核表达系统和用所述表达系统合成免疫毒素的方法；和纯化本专利技术的免疫毒素的方法。具体地，本专利技术涉及新的重组免疫毒素scFv(UCHT-1)-PE38，它是小鼠抗人CD3单克隆抗体，UCHT-1，的单链(“sc”)Fv片段与绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A的截短的片段，即PE38，融合形成的。例如，我们已发现上述scFv(UCHT-1)-PE38在体外对T细胞的杀伤是高效的；并且，我们也进一步发现该免疫毒素在人CD3ε转基因小鼠体内能以剂量依赖方式高水平消除小鼠CD3/人CD3双阳性T细胞。1.CD3结合域术语“CD3结合域”是指能与哺乳动物，更优选灵长类，甚至更优选人的T细胞或淋巴细胞上的CD3抗原结合或以其它关式关联的氨基酸序列。本专利技术免疫毒素的CD3结合域优选抗CD3多克隆或单克隆抗体，更优选单克隆抗CD3抗体。甚至更优选抗CD3抗体是能与人CD3ε链上的表位或由人CD3ε链和γ链形成的表位结合的单克隆抗体。此处所用术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白和各种形式已修饰过或改变了的抗体，包括抗体的片段，如Fv片段，由二硫键连接的Fv片段，或Fab或(Fab)’2片段，单链抗体，和保持亲代抗体的抗原结合功能和特异性的其它片段。抗体可以是动物(尤其是小鼠或大鼠)或人来源的，或是嵌合的或人源化的。能与CD3抗原，尤其是人CD3抗原特异结合的抗体可以用杂交瘤制备，杂交瘤可以用人们熟知的来源于Kohler和Milstein工作的方法制成。本领域熟知本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含ＣＤ３结合域和假单胞菌外毒素Ａ成分的分离的重组免疫毒素及其可药用盐。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：ME迪根，P雷克，RM莱特，
申请(专利权)人：诺瓦提斯公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]