鞘翅目毒性多肽组合物和抗虫转基因植物制造技术

本文公开了新的杀虫多肽以及包括这些多肽的组合物、包括其肽片段的组合物，及其特异性抗体。本文也公开了包含编码公开的δ－内毒素（δ－ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）多肽核酸区段的载体、转化的寄主细胞以及转基因植物。本文还公开了有关多肽和多核苷酸的鉴定方法、包括这些多肽序列的转基因细胞的制备方法和使用方法，以及昆虫群体如马铃薯甲虫（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ）、南方玉米根虫（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）和西方玉米根虫（ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）的防治方法，以及赋予植物对靶昆虫抗性的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请是在1999年5月4日签订的美国临时申请60/172240的基础上提出的，其完整内容在此引入作为参考。1.0专利技术背景1.1专利
本专利技术主要涉及分子生物学领域。某些实施方案更特别涉及包括来自细菌的DNA区段和蛋白质的方法和组合物。本专利技术更特别涉及来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的编码鞘翅目毒性晶体蛋白的新基因。本文公开了这些DNA区段、编码合成修饰的δ-内毒素多肽的DNA区段以及编码天然蛋白质和合成蛋白质的DNA区段的多种制取方法和使用方法。例如，DNA区段用作诊断探针以及蛋白质生产的模板，蛋白质、融合蛋白质载体和多肽在多种免疫和诊断方面的应用。本文还公开了在发展包含本文公开多核苷酸的转基因植物细胞过程中核酸区段的制取方法和使用方法。1.2相关领域有商业效益的作物通常是昆虫的攻击目标，所以在许多情况下需要的是防治和根除昆虫侵袭的环境敏感方法。对于农民、苗圃工、栽培者以及商业区和住宅区来说尤其如此，因为他们使用有利于生态的组合物防治昆虫群体。近年来发展的使用最广泛的环境敏感杀虫剂由来自于细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的微生物杀虫剂组成。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性细菌，产生的晶体蛋白或包含体对某些目和种的昆虫有特异的毒杀作用。许多苏云金芽孢杆菌菌株产生杀虫晶体蛋白。包括能产生杀虫蛋白质的苏云金芽孢杆菌菌株的组合物可商购。因为它们对特异的靶昆虫有特别强的毒杀作用而对植物以及其它非靶生物无害，因此可以用作环境可接受的杀虫剂。1.2.1 δ-内毒素δ-内毒素可以用来防治多种食叶毛虫、甲虫以及蚊子。这些蛋白质类的伴孢晶体，亦即杀虫晶体蛋白、晶体蛋白、Bt内含物、晶状包含体、包含体(inclusion body)以及Bt毒素(Bt toxin)，是由苏云金芽孢杆菌产生的晶体蛋白的大量集合体，对易感昆虫寄主的摄食有毒杀作用。过去的十年以来，有关苏云金芽孢杆菌毒素结构和功能的研究覆盖了所有主要毒素类别；虽然这些毒素在特异的结构和功能上有所不同，但是还是认为它们在结构和功能上有着普遍的相似性。在积累的苏云金芽孢杆菌毒素知识的基础上，提出来一种有关苏云金芽孢杆菌毒素普遍的作用模式，该模式包括昆虫摄食，昆虫中肠(由胃和小肠组成)中的溶解，对消化酶产生抗性(有时毒素的部分消化实际上却“激活”了毒素)，结合到中肠细胞上，昆虫细胞上形成穿孔并且破坏细胞内环境(English和Slatin，1992)。苏云金芽孢杆菌的独特特征之一是它在芽孢形成过程中产生晶体蛋白，晶体蛋白对某些目和种的昆虫有特异的毒杀作用。许多种苏云金芽孢杆菌菌株产生杀虫晶体蛋白。包括能产生对鳞翅目(lepidopteran)昆虫和双翅目(dipteran)昆虫有杀虫活性蛋白质的苏云金芽孢杆菌菌株的组合物可商购。因为它们对特异的靶昆虫有特别强的毒杀作用而对植物以及其它非靶生物无害，因此可以用作环境可接受的杀虫剂。过去十年中对苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的杀虫作用机制进行了大量的研究。研究表明，只有在晶体蛋白被昆虫摄食后蛋白质才对昆虫有毒杀作用。昆虫中肠中的碱性pH值和水解蛋白质的酶类将蛋白质溶解，因此使得对昆虫有毒杀作用的成分释放出来。这些毒性成分使中肠细胞破裂，使昆虫停止进食并最终导致昆虫死亡。正是因为这个原因，才证实苏云金芽孢杆菌在对付各种害虫时是一种有效且环境安全的杀虫剂。正如Hfte等(1989)所注意到的一样，大多数杀虫苏云金芽孢杆菌菌株对鳞翅目昆虫如毛虫(caterpillar insect)有活性。其它苏云金芽孢杆菌菌株对双翅目昆虫如蝇(fly)和蚊子(mosquito)有杀虫活性，或既对鳞翅目昆虫有杀虫活性又对双翅目昆虫有杀虫活性。近年来，有人报道几种苏云金芽孢杆菌菌株产生的晶体蛋白对鞘翅目(Coleoptera)昆虫如甲虫(beetle)有毒杀作用(Krieg等，1983；Sick等，1990；Donovan等，1992；Lambert等，1992a；1992b)。1.2.2编码晶体蛋白的基因许多δ-内毒素由于其氨基酸序列相似性而有不同程度的相关性。从研究过程来看，蛋白质以及编码这些蛋白质的基因主要在其杀虫谱的基础上进行分类。Hfte和Whiteley(1989)在综述中讨论了1990年以前苏云金芽孢杆菌中鉴定的基因和蛋白质，并且列出了苏云金芽孢杆菌基因和蛋白质常规使用的命名法和分类法。cry I基因编码毒杀鳞翅目的Cry I蛋白质，而cry II基因编码的Cry II蛋白质既对鳞翅目有毒杀作用又对双翅目有毒杀作用。cry III编码毒杀鞘翅目的Cry III蛋白质，而cry IV基因编码毒杀双翅目的Cry IV蛋白质。在序列相似性不同程度的基础上，蛋白质又分类到了亚族(subfamily)；每个家族(family)中更高程度相关的蛋白质用分类字母表示，如Cry IA、Cry IB、Cry IC，等等。每个分类中更为相关的蛋白质称为Cry IC1、Cry IC2等。近年来发展起来一种新的命名法，以氨基酸序列同源性为基础进行系统分类而并不是在靶昆虫特性的基础上进行分类(Crikmore等，1998)。4.3部分中概括了许多已知毒素的分类方法，其中并不包括各蛋白质中的等位变异(allelic variation)。1.2.3对鞘翅目昆虫有毒杀作用的晶体蛋白已有人对cry3Bb基因的克隆和表达作了描述(Donovan等，1992)。该基因编码的74-kDa蛋白质对鞘翅目昆虫如马铃薯甲虫(Coloradopotato beetle，CPB)和南方玉米根虫(southern corn rootworm，SCRW)有杀虫活性。据报道，苏云金芽孢杆菌菌株PS201T6对西方玉米根虫(WCRW，Diabrotica virgifera virgifera)有效，美国专利5436002(其完整内容在此特别引入作为参考)对该菌株作了描述。该菌株对Muscadomestica、Aedes aegypti以及Liriomyza trifoli也显示了活性。也有人对cryET29基因的克隆和表达作了描述(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO97/17507，1997)。该基因编码的25-kDa蛋白质对鞘翅目昆虫尤其是CPB、SCRW、WCRW以及跳蚤(cat flea)和Ctenocephalides felis有效。有人对cryET33基因和cryET34基因的克隆和表达作了描述(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO97/17600，1997)。这两个基因分别编码～30kDa和～15kDa的蛋白质，对鞘翅目昆虫尤其是CPB幼虫和日本甲虫(Popillia japonica)有效。vip1A基因产生的是营养期(vegetative)可溶性蛋白质，该基因已经克隆并测序(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO96/10083，1996)。该基因编码的蛋白质大约为80kDa，既对WCRW有效又对北方玉米根虫(northern corn rootworm，NCRW)有效。另一个对包括W本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２中至少１５个连续氨基酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４中至少１５个连续氨基酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４中至少１５个连续氨基酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６中至少１５个连续氨基酸或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９中至少１５个连续氨基酸的分离多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：MJ鲁帕，WP多诺范，CR楚，E佩斯，Y谭，AC斯拉尼，TM马尔瓦，JA鲍姆，
申请(专利权)人：孟山都技术有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]