一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法，其包括以下步骤：1)制备供试品溶液；2)用色谱和质谱联用的方法对样品进行分析；3)采用特征离子定性鉴别的方法对样品进行鉴定。该技术方案可以对中华穿山甲、树穿山甲、印度穿山甲进行基源鉴定，准确性高、专属性强，克服性状鉴别、DNA检测的不足。

A test method for the identification of the genus pangolin

The invention discloses a liquid chromatography-mass detection method for identifying pangolin species. It includes the following steps: 1) preparation of sample solution; 2) analysis of samples by chromatography and mass spectrometry; 3) identification of samples by qualitative identification of characteristic ions. This technology scheme can identify Chinese Pangolin, pangolin and pangolin in India. It has high accuracy and specificity, and overcomes the deficiency of character identification and DNA detection.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法
本专利技术涉及一种中药基源鉴定的检测方法，特别涉及一种穿山甲种属鉴定的检测方法及应用，属于药物分析技术及种质资源鉴定领域。
技术介绍
《中国药典》2015年版规定穿山甲来源于鲮鲤科动物中华穿山甲ManispentadactylaLinnaeus的鳞甲，具有活血消癥，通经下乳，消肿排脓，搜风通络的功效，用于经闭癥瘕，乳汁不通，痈肿疮毒，风湿痹痛，中风瘫痪，麻木拘挛等症。临床上一般使用它的炮制品：炮山甲和醋山甲。炮山甲是穿山甲生品经砂烫制得；醋山甲是经砂烫醋淬制得。穿山甲为国家二级野生保护动物，其疗效确切，但饲养难度比较大，药用资源紧缺，药材价格逐年上涨。市场上一些不法商贩用猪、牛、羊蹄甲掺伪，或用走私的印度穿山甲M.crassicaudata和树穿山甲M.tricuspisLinnaeus替代使用或混用，导致穿山甲药材质量参差不齐，市场秩序混乱。然而，由于缺乏专属性鉴别方法和高灵敏度的检测技术，面对上述问题，药品检验和监管部门却束手无策。因此，建立准确性好、灵敏度高、专属性强的穿山甲饮片的质量控制技术和方法，并应用于相关药品的质量控制标准中，对推进我国药材市场质量监管的科学性与有效性，对保障公众用药安全有效、维护市场公平公正以及保护消费者利益等方面有积极的影响。在穿山甲质量标准及其相关的研究资料中，传统的性状鉴别可区别不同种穿山甲，但性状鉴别属于经验鉴别，可能有人为主观因素的影响，且穿山甲在炮制后变形、变脆、易断，甚至粉碎后的穿山甲成品(穿山甲配方颗粒)、含穿山甲的成方制剂等，在外观性状大小大多不复存在，所以无法判断穿山甲的基源；用PCR-DNA等蛋白质类成分的通用检测方法，专属性不强，穿山甲在炮制过程中，砂烫的温度和时间等因素造成胶原蛋白不同程度的破坏，直接影响上述方法测定结果的稳定性和重现性，且该方法只适用于对正品和纯伪品的鉴别，而对于正品中掺加部分伪品的问题无能为力。因此，需要找到一种新的方法对穿山甲的基源进行鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法，其包括以下步骤：1)制备供试品溶液；2)用色谱和质谱联用的方法对样品进行分析；3)采用特征离子定性鉴别的方法对样品进行鉴定。优选的，穿山甲种属的物种为中华穿山甲，树穿山甲，印度穿山甲。优选的，制备供试品溶液的方法是：取穿山甲样品，捣碎打粉，过六号筛，称取粉末10mg，置10ml量瓶中，加8M尿素1ml，再加1M的二硫苏糖醇10μl，水浴60℃加热30min，放冷，加入1M的碘乙酰胺30μl，黑暗静置30min，加1％NH4HCO3溶液稀释至10ml，加1μg/μl的胰蛋白酶溶液20μl，摇匀，37℃恒温酶解15h以上，即得。优选的，色谱条件为：以AgilentZorbax300SB-C18(3.5μm，2.1×100mm)为色谱柱，流速0.15ml/min，柱温40℃，进样量3μl；以0.1％甲酸-水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～10min，5％～10％B；10～45min，10％～25％B；45～70min，25％～40％B；70～75min，40％～95％B；75～82min，95％B；82～85min，95％～5％B；85～95min，5％B。优选的，质谱条件为：以液相色谱-飞行时间质谱LC-QTOF为分析检测仪器，离子化模式为DualESI-Positive正离子模式；毛细管电压3000V，锥孔电压65V，毛细管出口电压175V，除溶剂温度300℃，除溶剂气体8L/min；采用profile采集方式，扫描范围100-3000m/z，扫描时间1spectra/s。优选的，检测方法的鉴定依据是：色谱和一级质谱联用检测时，中华穿山甲的特征离子m/z615.2910，所带电荷数2，保留时间为24.870min；色谱和二级质谱联用检测时，中华穿山甲还含有特征碎片离子m/z775.3、m/z832.3。优选的，检测方法的鉴定依据是：色谱和一级质谱联用检测时，树穿山甲有三个特征离子，分别为特征离子m/z451.4920，所带电荷数4，保留时间为37.740min；特征离子m/z483.7659所带电荷数4，保留时间为31.329min；特征离子m/z732.0417，所带电荷数3，保留时间为51.177min；色谱和二级质谱联用检测时，树穿山甲特征离子为m/z451.4920的，还含有特征碎片离子m/z540.6、m/z564.0；特征离子为m/z483.7659的还含有特征碎片离子m/z583.3、m/z606.6；特征离子为m/z732.0417的还含有特征碎片离子m/z921.5、m/z1172.6。优选的，检测方法的鉴定依据是：色谱和一级质谱联用检测时，印度穿山甲的特征离子m/z435.1988，所带电荷数2，保留时间为13.756min；色谱和二级质谱联用检测时，印度穿山甲还含有特征碎片离子m/z482.2、m/z539.3。本专利技术的有益效果是：本专利技术的技术方案可以对中华穿山甲、树穿山甲、印度穿山甲进行基源鉴定，准确性高、专属性强，克服性状鉴别、DNA检测的不足。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本专利技术的技术方案，但不作为对本专利技术方案的限定。实施例1酶解肽图的建立1.1仪器与材料：Agilent6540UHDAccurate-MassQ-TOFLC/MS；色谱柱：AgilentZorbax300SB-C18(3.5μm，2.1×100mm)。胰蛋白酶购自Sigma、Promega公司和中国食品药品检定研究院。二硫苏糖醇、碘乙酰胺、甲酸购自Sigma公司。碳酸氢铵为分析纯。中华穿山甲对照药材来源于中国食品药品检定研究院。树穿山甲和印度穿山甲工作对照药材经广东省药品检验所鉴定供本研究用。1.2样品处理：取穿山甲样品，捣碎打粉，过6号筛，称取粉末10mg，加8M尿素1ml，再加1M的二硫苏糖醇10μl，水浴60℃加热30min，放冷，加入1M的碘乙酰胺30μl，黑暗静置30min，加1％NH4HCO3溶液稀释至10ml，加胰蛋白酶溶液(1μg/μl)20μl，摇匀，37℃恒温酶解15h以上。取上述溶液适量，过0.22μm的滤膜，取续滤液置进样瓶中，即得。1.3液相条件：以AgilentZorbax300SB-C18(3.5μm，2.1×100mm)为色谱柱，流速0.15ml/min，柱温40℃，进样量3μl。以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～10min，5％～10％B；10～45min，10％～25％B；45～70min，25％～40％B；70～75min，40％～95％B；75～82min，95％B；82～85min，95％～5％B；85～95min，5％B。1.4质谱条件：离子化模式为DualESI-Positive正离子模式。毛细管电压3000V，锥孔电压65V，毛细管出口电压175V，除溶剂温度300℃，除溶剂气体8L/min。采用profile采集方式，扫描范围100-3000m/z，扫描时间1spectra/s。1.5不同种穿山甲的特征肽图：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法，其包括以下步骤：1)制备供试品溶液；2)用色谱和质谱联用的方法对样品进行分析；3)采用特征离子定性鉴别的方法对样品进行鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法，其包括以下步骤：1)制备供试品溶液；2)用色谱和质谱联用的方法对样品进行分析；3)采用特征离子定性鉴别的方法对样品进行鉴定。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述穿山甲种属的物种为中华穿山甲，树穿山甲，印度穿山甲。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述制备供试品溶液的方法是：取穿山甲样品，捣碎打粉，过六号筛，称取粉末10mg，置10ml量瓶中，加8M尿素1ml，再加1M的二硫苏糖醇10μl，水浴60℃加热30min，放冷，加入1M的碘乙酰胺30μl，黑暗静置30min，加1％NH4HCO3溶液稀释至10ml，加1μg/μl的胰蛋白酶溶液20μl，摇匀，37℃恒温酶解15h以上，即得。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件为：以AgilentZorbax300SB-C18为色谱柱，流速0.15ml/min，柱温40℃，进样量3μl；以0.1％甲酸-水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～10min，5％～10％B；10～45min，10％～25％B；45～70min，25％～40％B；70～75min，40％～95％B；75～82min，95％B；82～85min，95％～5％B；85～95min，5％B。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质谱条件为：以液相色谱-飞行时间质谱LC-QTOF为分析检测仪器，离子化模式为DualESI-Positive正离子模式；毛细管电压3000V，锥孔电压65V，毛细管出口电压175...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘潇潇，罗卓雅，李华，谢健鸣，乔莉，
申请(专利权)人：广东省药品检验所广东省药品质量研究所，广东省口岸药品检验所，
类型：发明
国别省市：广东,44