一种黑色素转运抑制率的快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种黑色素转运抑制率的快速检测的方法，包括以下步骤：(1)配制完全培养基。(2)取对数期的黑色素细胞，调成特定密度的细胞悬液并加进培养皿中(同时设置空白对照组、阳性对照组和实验组)，待细胞贴壁后，往实验组中加入实验样品，培养一段时间后，收集培养基，将培养基按特定体积加进孔板中。(3)采用酶标仪对空白对照组的细胞培养基进行全波长扫描，即得到全波长的样品光谱图；根据扫描的光谱曲线确定最大吸收波长的位置。(4)根据步骤(3)得到的波长测量步骤(2)中的培养基的吸光度，根据公式算出黑色素转运的抑制率。该方法灵敏度高、操作简单便捷，可准确算出黑色素转运的抑制率。

A rapid detection method for the inhibition rate of melanin transport

The present invention discloses a method for rapid detection of melanin transport inhibition rate, including the following steps: (1) preparing a complete medium. (2) melanoma cells in logarithmic phase, tune into the specific density of the cell suspension and added to the culture dish (and blank control group, positive control group and experimental group), after cell adhesion is added into the experimental samples in the experimental group, after a period of culture, the culture medium was collected. According to the specific volume of culture medium added orifice plate. (3) use the enzyme labelling instrument to scan the cell culture medium of the blank control group, get the full wavelength sample spectrum, and determine the location of the maximum absorption wavelength according to the scanning spectral curve. (4) according to the absorbance of the medium in the wavelength measurement step (2) obtained by step (3), the inhibition rate of the melanin transport is calculated according to the formula. This method has high sensitivity and simple and convenient operation, and can accurately calculate the inhibition rate of melanin transport.

【技术实现步骤摘要】
一种黑色素转运抑制率的快速检测方法
本专利技术涉及黑色素检测
，具体涉及一种黑色素转运抑制率的快速检测的方法。
技术介绍
黑色素是广泛存在于人的皮肤、粘膜、视网膜、软脑膜及胆囊与卵巢等处，它的存在与人体皮肤、毛发及眼睛的颜色密切相关。黑色素的主要生物功能有抵抗紫外线，减少炎症，皮肤病的发生，因此，黑色素细胞中的黑色素的存在以及含量有着极为重要的生物学意义。黑色素是由黑素细胞产生的,成熟的黑素细胞位于表皮细胞的基底层,是一种树枝状细胞。每一个黑素细胞连接大约36个角朊细胞,构成一个表皮黑素单位。皮肤黑素的产生过程包括从黑素细胞的迁移,黑素细胞的分裂成熟,黑素小体的形成,黑素颗粒的转运到临近的角质形成细胞内，最终导致皮肤的色素沉着。目前，白皙的皮肤是众多亚洲人群(特别是女性)所追求的目标，这就促进了各种皮肤美白的手段的衍生。而对于美白化妆品的开发，黑色素成为最直接的作用靶点。另外，目前大部分对于黑色素的检测仅限于黑色素细胞内黑色素含量的测定——针对胞内黑色素合成的抑制作用检测，而忽略了美白活性物质对黑色素转运的抑制作用的验证。因此，开发一种快速、有效的黑色素细胞外黑色素检测方法将具有很好的实用价值和现实意义。黑色素细胞在正常培养状态下，会自主分泌黑色素，使培养基呈现黑色。黑色素是一种包含多种二羟基吲哚和苯酚单位的异质聚合物，是皮肤组织中最重要的生色团之一。这一独特的化学结构决定了黑色素具有良好的光学性质。相对于传统的黑色素转运的检测方法——在黑色素细胞与角质细胞共培养体系中通过共聚焦显微镜或流式细胞仪观察黑色素小体从黑色素细胞向角质细胞转运的情况，本专利技术的方法有望实现灵敏度高、操作简便、时间短、成本低，同时可得到黑色素转运抑制率的数据的胞外黑色素检测。目前常用的黑色素细胞外黑色素检测方法——共聚焦显微镜或流式细胞仪观察黑色素小体在细胞共培养体系中的转运情况，可以通过CFDA-SE荧光标记的黑色素细胞与角质细胞共培养，最后在共聚焦显微镜中观察细胞共培养体系中黑色素小体的转运情况；利用这种方法可实现黑色素转运情况的检测。但是，这种方法有如下几个缺点：1)实验步骤较多且复查，实验周期长，不能实现高效快速的检测；2)定性检测，该法的检测标准是通过肉眼的判定，只能得到定性的结果，无法定量，无法计算出黑色素转运的抑制率；3)灵敏度不高，在显微镜下肉眼判断黑色素是否存在，只有达到肉眼可识别的颗粒大小才能被检测出，那些更小的颗粒则无法检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种黑色素转运抑制率的快速检测的方法，该方法灵敏度高、操作简单便捷，可准确算出黑色素转运的抑制率。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现：一种黑色素细胞的黑色素转运抑制率的快速检测方法，包括以下步骤：(1)配制完全培养基。(2)取对数期的黑色素细胞，用步骤(1)配制的完全培养基将细胞调成特定密度的细胞悬液并加进100mm培养皿中(同时设置空白对照组、阳性对照组和实验组)，把细胞放进培养箱中培养，待细胞贴壁后，往实验组中加入特定浓度的实验样品，培养48小时后，收集细胞培养基，将培养基按顺序加进96孔板中，每孔200uL。(3)采用酶标仪对步骤(2)中的空白对照组的细胞培养基进行全波长扫描，放置样品，对样品进行扫描，放上待测样品，执行扫描，即得到全波长的样品光谱图；扫描出来的吸光度值和波长的关系曲线就是培养基中黑色素的光谱曲线；根据扫描的光谱曲线确定最大吸收波长的位置。(4)根据步骤(3)得到的波长测量步骤(2)中的培养基的吸光度，根据公式算出黑色素转运的抑制率。在上述黑色素细胞的黑色素转运抑制率的检测方法中：步骤(1)中的完全培养基为无酚红DMEM培养基，含10％FBS和1％双抗。步骤(2)中得到细胞悬液的具体步骤为取对数期的黑色素细胞，去掉原有培养基，取2mlPBS冲洗培养瓶底部的细胞，倒掉PBS，外加入2ml胰酶，消化3min后，加入步骤(1)的完全培养基3ml终止消化，并把细胞从培养瓶底部吹打下来，转移至15ml离心管中，于低速离心机中1200r/min离心5min，弃去上清液，往细胞团中加入适量完全培养基吹散细胞团，用细胞计数器计算细胞密度，并把细胞悬液密度调成1×105个/ml，往100mm培养皿中加入10ml细胞悬液。步骤(2)中采用的培养箱为CO2培养箱，37℃，含体积百分含量为5％的CO2。步骤(3)中酶标仪为全波长酶标仪，酶标仪设置扫描波长的范围：一般在200-600nm之间。步骤(3)中酶标仪设置扫描模式：一般选择ABS(吸光度)，设置扫描间距：即采样间距，一般选择1nm；对仪器进行基线扫描，即选择空白校准这步是给仪器调一个0％线和100％线。步骤(4)采用的计算公式为黑色素转运抑制率＝1-OD实验组/OD空白组*100％。本专利技术通过使用全波长酶标仪对黑色素细胞培养基进行全波长扫描，确定培养基中黑色素的最大吸收波长，所确定的波长可用于测量实验组以及空白组的培养基的吸光度，通过计算可得出黑色素转运的抑制率。与现有技术相比，本专利技术有如下有点：(1)灵敏度高，直接检测培养基中黑色素的吸光度，可实现更微小尺度的黑色素检测。(2)操作简单便捷，实验周期短，本法直接收集实验中的细胞培养基，于全波长酶标仪中测量吸光度，操作简单，耗时短。(3)可准确算出黑色素转运的抑制率，通过公式：×可实现黑色素转运抑制率的准确计算。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。图1是实施例1中培养基的颜色对照(光甘草定实验组培养基颜色组)，a是空白组的培养基图，b是实验组培养基图，b-1、b-2和b-3分别是光甘草定的低、中、高实验组的培养基图；图2是实施例2中培养基的颜色对照(烟酰胺实验组培养基颜色组)，a是空白组的培养基图，b是实验组培养基图，b-1、b-2和b-3分别是烟酰胺的低、中、高实验组的培养基图；图3是实施例3中培养基的颜色对照(a-MSH实验组培养基颜色组)，a是空白组的培养基图，b是实验组培养基图，b-1、b-2和b-3分别是a-MSH的低、中、高实验组的培养基图；图4是实施例中对空白组中培养基在200-600nm区间内进行波长扫描的光谱图；图5是实施例1中各光甘草定对黑色素细胞黑色素转运的抑制率；图6是实施例2中各烟酰胺对黑色素细胞黑色素转运的抑制率；图7是实施例3中各a-MSH对黑色素细胞黑色素转运的抑制率。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1本实施例提供的黑色素转运抑制率的快速检测的方法，包括以下步骤：(1)试剂配制：1)完全培养基，取500ml的无酚红DMEM培养基，加入55ml胎牛血清以及5.5ml，摇匀备用；2)1nM/ml光甘草定溶液，称取0.324mg光甘草定于1.5ml离心管中，加DMSO溶解至1ml，配制成1uM/ml的母液。(2)样品处理，取对数期的黑色素细胞，去掉原有培养基，取2mlPBS冲洗培养瓶底部的细胞，倒掉PBS，外加入2ml胰酶，消化3min后，加入完全培养基3ml终止消化，并把细胞从培养瓶底部吹打下来，转移至15ml离心管中，于低速离心机中1200r/min离心5min，弃去上清液，往细胞团中加入适量完全培养基吹散细胞团，用细胞计数器计算细胞密度，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黑色素细胞的黑色素转运抑制率的快速检测方法，其特征是包括以下步骤：（1）配制完全培养基；（2）取对数期的黑色素细胞，用步骤（1）配制的完全培养基将细胞调成特定密度的细胞悬液并加进100mm培养皿中（同时设置空白对照组、阳性对照组和实验组），把细胞放进培养箱中培养，待细胞贴壁后，往实验组中加入特定浓度的实验样品，培养48小时后，收集细胞培养基，将培养基按顺序加进96孔板中，每孔200uL；（3）采用酶标仪对步骤（2）中的空白对照组的细胞培养基进行全波长扫描，放置样品，对样品进行扫描，放上待测样品，执行扫描，即得到全波长的样品光谱图；扫描出来的吸光度值和波长的关系曲线就是培养基中黑色素的光谱曲线；根据扫描的光谱曲线确定最大吸收波长的位置；（4）根据步骤（3）得到的波长测量步骤（2）中的培养基的吸光度，根据公式算出黑色素转运的抑制率。

【技术特征摘要】
1.一种黑色素细胞的黑色素转运抑制率的快速检测方法，其特征是包括以下步骤：（1）配制完全培养基；（2）取对数期的黑色素细胞，用步骤（1）配制的完全培养基将细胞调成特定密度的细胞悬液并加进100mm培养皿中（同时设置空白对照组、阳性对照组和实验组），把细胞放进培养箱中培养，待细胞贴壁后，往实验组中加入特定浓度的实验样品，培养48小时后，收集细胞培养基，将培养基按顺序加进96孔板中，每孔200uL；（3）采用酶标仪对步骤（2）中的空白对照组的细胞培养基进行全波长扫描，放置样品，对样品进行扫描，放上待测样品，执行扫描，即得到全波长的样品光谱图；扫描出来的吸光度值和波长的关系曲线就是培养基中黑色素的光谱曲线；根据扫描的光谱曲线确定最大吸收波长的位置；（4）根据步骤（3）得到的波长测量步骤（2）中的培养基的吸光度，根据公式算出黑色素转运的抑制率。2.根据权利要求1所述的黑色素细胞的黑色素转运抑制率的快速检测方法，其特征是：步骤（1）中的完全培养基为无酚红DMEM培养基，含10%FBS和1%双抗。3.根据权利要求1所述的黑色素细胞的黑色素转运抑制率的快速检测方法，其特征是：步骤（2）中得到细胞悬液的具体步骤为取对数期的黑色素细胞，去掉原有培养基，取2mlPBS冲洗培养瓶底部的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：林丽，郑雅婷，杜志云，郑希，
申请(专利权)人：佛山市康伲爱伦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44