一种SARS病毒DNA疫苗pVPS制造技术

本发明专利技术涉及医药生物工程技术领域，是一种用于预防严重急性呼吸道综合征的ＳＡＲＳ病毒ＤＮＡ疫苗ｐＶＰＳ。它由ＳＡＲＳ病毒Ｓ蛋白抗原决定簇编码序列与纤溶酶原激活剂ＴＰＡ的信号肽编码序列组成的分泌型Ｓ蛋白抗原决定簇编码序列Ｓ－Ｐ，插入真核表达载体所构成。该重组质粒转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α就成ｐＶＰＳ工程菌，可用于制备疫苗ｐＶＰＳ。由于其表达的抗原蛋白能分泌到细胞外，从而增强了体液免疫，起到更好的预防ＳＡＲＳ病毒感染的作用。本发明专利技术ＤＮＡ疫苗制备工艺简单，成本低廉，可在真核细胞中表达Ｓ－Ｐ抗原并可激活淋巴细胞。故可作为预防严重急性呼吸道综合征的ＤＮＡ疫苗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及医药生物工程
，是一种用于预防严重急性呼吸道综合征的SARS病毒DNA疫苗pVPS。
技术介绍
世界卫生组织将严重急性呼吸道综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome；SARS)简称萨斯病，并确认是一种SARS病毒(SARS coronavirus)引起的传染性疾病。目前尚无针对SARS病毒的特效药，研制有效的预防性疫苗势在必行。DNA疫苗，是近年兴起的新型疫苗，具有抗体效价维持时间长和交叉保护效果好等优点。此外DNA疫苗还具有以下突出优点(1)能诱发体液及细胞全方位免疫应答，起到预防作用；(2)免疫保护时间长；(3)生产工艺简单、成本低廉、稳定性好且贮运方便。
技术实现思路
本专利技术提供一种SARS病毒DNA疫苗pVPS，可用于预防人严重急性呼吸道综合征。其作用机理为将SARS病毒表面抗原S抗原决定簇编码序列插入真核表达载体，将其注射于肌肉组织，使其在肌细胞中表达病毒表面抗原，经过抗原提呈过程，可激活体内的体液免疫系统和细胞免疫系统。激活的体液免疫系统可产生特异的抗体，消除游离在血液中的病毒，预防SARS病毒的入侵；而激活的细胞免疫系统可产生细胞毒淋巴细胞(CTL)，攻击已被感染的细胞，消除隐藏的SARS病毒。目前已知，S蛋白是存在于SARS病毒表面的糖蛋白，参与病毒入侵细胞时的受体结合、细胞融合，是病毒的主要抗原。已知的SARS病毒CUHK-W1(GENEBANKnumberAY278554)、HKU-39849(GENEBANK numberAY278491)、BJ01(GENEBANKnumberAY278488)、BJ02(GENEBANK numberAY278487)、BJ03(GENEBANK numberAY278490)、BJ04(GENEBANK numberAY279354)、GZ01(GENEBANK numberAY278489)等株中的基因具有极高的同源性。它们的S基因基本结构为全长3768bp，编码1255个氨基酸的成熟蛋白。本专利技术对S蛋白进行抗原决定簇分析，选择编码抗原决定簇的编码序列作为插入的外源DNA序列，其结构为TATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTTAA鉴于人TPA(纤溶酶原激活剂)的信号肽具有将蛋白质前体搬运到细胞膜，之后信号肽被切割，成熟蛋白就分泌到细胞外的功能，故将其编码序列接在S抗原决定簇编码序列前端，所组成的SARS病毒分泌型S蛋白抗原决定簇编码序列简称为S-P，其表达的抗原蛋白能分泌到细胞外，从而大大提高体液免疫，起到更好的预防病毒感染的作用。本专利技术SARS病毒DNA疫苗pVPS的制备方法如下1.人工合成SARS病毒分泌型S蛋白抗原决定簇编码序列S-P(见核苷酸序列表1)a)序列特征长度282bp类型核酸链数双链几何结构线性b)分子类型DNAc)来源人工合成d)序列描述分泌型S蛋白抗原决定簇编码序列S-P ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGATCTGAATTCTATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTTAA 其中，加下划线的序列为TPA的人信号肽编码序列，共114bp；5’末端的 为Hind III酶切位点；3’末端的 是Xho I酶切位点。2.制备DNA疫苗pVPS用限制性内切酶Hind III和Xho I分别对上述合成的DNA片段S-P和真核表达载体pVAX1(购自Invitrogen公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录)进行双酶切，酶切片段分别经琼脂糖凝胶电泳纯化回收。然后将上述pVAX1载体酶切片段与S-P酶切片段按一定比例混合，通过连接酶进行连接，以CaCl2法将其转化至感受态大肠杆菌DH5α(购自GIBLCO公司)中，在卡那霉素平板上得到转化子，进行筛选。筛选到的阳性转化子为重组pVPS的工程菌，该工程菌可用于制备DNA疫苗pVPS。本专利技术DNA疫苗是真核表达载体pVAX1与S-P DNA片段的重组质粒。该重组质粒含有pUC ori质粒复制起始位点、卡那霉素抗性基因Kanamycin、一个完整的真核转录翻译单元的巨细胞病毒启动子PCMV、SARS病毒分泌型S蛋白抗原决定簇编码序列S-P及3’端的多聚腺苷酸BGH pA。本专利技术DNA疫苗制备工艺简单，成本低廉，可在真核细胞中表达S-P抗原并可激活淋巴细胞。其表达的抗原蛋白能分泌到细胞外，从而大大提高体液免疫，预防病毒感染的作用更强。附图说明图1为本专利技术SARS病毒DNA疫苗pVPS的结构示意2为本专利技术SARS病毒DNA疫苗pVPS的构建流程图具体实施例方式下面结合实施例，对本专利技术的制备方法作详细描述。实施例1SARS病毒DNA疫苗pVPS的制备DNA疫苗pVPS结构见图1，构建流程见图2。1.合成S-P DNA序列(结构如前所述)，其5’末端含Hind III酶切位点 3’末端含Xho I酶切位点 2.构建pVPS的重组质粒用限制性内切酶Hind III和Xho I对S-P DNA片段进行双酶切。反应体系为S-P DNA片段5μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mM Dithionthreitol；500mM NaCl)2μl；Hind III酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；补H2O至总体积20μl。37℃温浴消化2小时。之后将消化样品进行1％低溶点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收S-P酶切片段。同时，用Hind III和Xho I双酶切pVAX1载体。反应体系为pVAX1载体2μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mM Dithionthreitol；500mM NaCl) 2μl；Hind III酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；补水至总体积20μl。37℃温浴消化2小时。之后将消化样品进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pVAX1酶切片段。将上述pVAX1酶切片段与S-P酶切片段混合，以连接酶进行连接。连接反应体系为pVAX1酶切片段0.5μl(200ng/μl)；S-P酶切片段1μl(50ng/μl)；连接Buffer(660mM Tris-Hcl pH7.6；66mM MgCl2；100mM DTT；1mM AT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＳＡＲＳ病毒ＤＮＡ疫苗ｐＶＰＳ，其特征在于由分泌型Ｓ蛋白抗原决定簇编码序列Ｓ－Ｐ和真核表达载体构成，Ｓ－Ｐ的核苷酸序列如下：ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡ ＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＣ ＴＧＧＡＣＴＡＡＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＣＴＴＴＧＴＴＧＣＡＴＧＡＣＴＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＣＴＣＡＡＧＧＧＴＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙树汉，郭瀛军，黄力，王开宇，张术，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]