一种香蕉黑星病菌LAMP检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种香蕉黑星病菌LAMP检测引物及其应用，专用于香蕉黑星病菌的特异性检测，属于农作物病害检测和生物技术领域。本发明专利技术设计了一种香蕉黑星病菌LAMP检测引物，包括外引物F3和B3，以及内引物FIP和BIP，序列见SEQ ID NO.1‑4。基于该引物建立的香蕉黑星病菌检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。所发明专利技术的LAMP检测引物及其检测方法能在生产实践中实现香蕉黑星病菌的快速、灵敏、准确检测，同时可用于田间香蕉黑星病的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为香蕉黑星病的早期预警和防控提供可靠的技术和理论依据。

A LAMP primer for the detection of banana Black Star pathogen and its application

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉黑星病菌LAMP检测引物及其应用
本专利技术涉及一种香蕉黑星病菌LAMP检测引物及其检测方法，专用于香蕉黑星病菌的快速检测，同时可实现田间香蕉黑星病的早期诊断和病菌的监测、鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物

技术介绍
香蕉是世界上产量最大的水果作物，也是世界著名的热带、亚热带水果，也是中国热带亚热带的主要水果。香蕉其具有独特的品味和较高的营养价值，历来堪称一种上乘的保健果品。中国是世界香蕉主产国之一，具有悠久的栽培历史，也是世界的香蕉种植生产大国之一，香蕉的栽培面积和产量居全国水果的第四位。香蕉黑星病又称黑痣病、雀斑病，可为害香蕉叶片、果柄和果实，在我国各香蕉种植区普遍存在。发病时叶片及中脉产生许多散生或群生的突起小黑斑，直径约lmm，其周缘淡褐色，中部稍下陷，上着生小黑粒。病斑密集成块斑，最后导致叶片枯黄，果实发病，症状常在断蕾后2～4周出现，多在果指弯腹部分，严重时全果均有，初期为红棕色、外围暗绿色水晕，随着果实肉度增大，病斑密度增大，严重的扩展至全果，影响果实的外观和耐贮性，近年来香蕉黑星病在我国香蕉产区普遍发生且为害日益严重，已成为香蕉生产上的重要病害之一。香蕉黑星病菌(Phyllostictamusarum)在PDA、PSA和V8等常见培养基上生长很缓慢，在进行分离时菌落常常被杂菌所覆盖，而且分生孢子器产生时间晚，难以在早期鉴别。到1972年还未获得纯培养，除此之外以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，难以满足香蕉黑星病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，PCR（polymerasechainreaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断，但其需要昂贵的仪器设备，难以在基层部门实现快速、准确的检测。环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30min-60min内实现109-1010倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比PCR技术，LAMP技术全程恒温反应，无需PCR仪，且扩增量大灵敏度高。目前LAMP检测已成功应用于人畜病原物、食品安全、环境安全及多种植物病原物检测的报道，但目前有关香蕉黑星病菌LAMP检测的研究尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中对香蕉黑星病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，PCR检测需要依靠扩增仪等设备的问题，提供了一种香蕉黑星病菌LAMP检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案：1.香蕉黑星病菌LAMP检测引物的设计根据香蕉黑星病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对香蕉黑星病菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物，包括2条外引物（F3和B3）和2条内引物（FIP和BIP），其核苷酸序列分别为：F3：5’-CGGATCTCTTGGTTCTGGC-3’；B3：5’-TACGCTCGAGGCTAGGAC-3’；FIP:5’-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-3’；BIP:5’-TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAAGGTCTTCAAGGCCCGTC-3’。2.建立香蕉黑星病菌LAMP检测方法，包括以下步骤：(1)从待检测样品中提取DNA；用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA；用于检测香蕉植株组织是否存在香蕉黑星病菌时，采用NaOH快速裂解法提取香蕉植株组织基因组DNA。(2)以提取待测样品DNA为模板进行LAMP扩增检测：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2mmol/L的F3和B3，1.6mmol/L的FIP和BIP，BstDNA聚合酶为8U，DNA模板50～100ng，12.5uL的LAMP反应混合液（40mMTris-HCl，20mM(NH4)2SO4，20mMKCl，16mMMgSO4，1.6mol/L甜菜碱，2.0mMdNTPs，0.2%TrionX-100），用无菌的超纯水补足25uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。(3)LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBRgreenI1.0uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0uLLAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，没有出现梯形条带则判断为阴性。本专利技术的有益效果在于：（1）特异性强、准确性高：本专利技术是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点，选取了6个特定区域设计了对香蕉黑星病菌具有特异扩增作用的4条LAMP引物。已经对不同地理来源的香蕉黑星病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉弯孢霉叶斑病菌、携带香蕉黑星病菌的植物组织和健康的香蕉组织进行了检测验证，只有香蕉黑星病菌和携带该病菌的组织呈现阳性，说明本专利技术所设计的引物及检测方法用于检测香蕉黑星病菌准确可靠，能有效区分发生在香蕉上症状特征相似的病害；（2）灵敏度高：LAMP对香蕉黑星病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达10fg，具有很高的灵敏度；（3）适用性广、实用性好：本专利技术的香蕉黑星病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的香蕉组织进行检测，可实现香蕉黑星病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防止病害的爆发流行。（4）操作简便快速：LAMP是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，结果可视化，一般整个检测过程可在1.5小时内完成，操作简便快捷。附图说明图1为本专利技术LAMP检测方法对香蕉黑星病菌的特异性检测结果：其中上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2为阳性对照、泳道3-5为香蕉黑星病菌，泳道6-11分别为：香蕉炭疽病菌、香蕉弯孢霉叶斑病菌、香蕉尾孢叶斑病菌、香蕉枯萎病菌、芦笋茎枯病菌、阴性对照。其中可视化显色结果2-5显示绿色荧光，其他不显示。图2为本专利技术LAMP检测方法对香蕉黑星病菌的灵敏性检测结果：其中上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-11的模板DNA浓度分别为：10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照。其中可视化显色结果中9、10不显示绿色荧光，其他显示绿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香蕉黑星病菌LAMP检测引物，其特征在于：所述的香蕉黑星病菌LAMP检测引物由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成，各引物核苷酸序列为：F3：5’‑CGGATCTCTTGGTTCTGGC‑3’；B3：5’‑TACGCTCGAGGCTAGGAC‑3’；FIP: 5’‑GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAAGAACGCAGCGAAATGC‑3’；BIP: 5’‑TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAAGGTCTTCAAGGCCCGTC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种香蕉黑星病菌LAMP检测引物，其特征在于：所述的香蕉黑星病菌LAMP检测引物由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成，各引物核苷酸序列为：F3：5’-CGGATCTCTTGGTTCTGGC-3’；B3：5’-TACGCTCGAGGCTAGGAC-3’；FIP:5’-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-3’；BIP:5’-TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAAGGTCTTCAAGGCCCGTC-3’。2.一种香蕉黑星病菌LAMP检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的香蕉黑星病菌LAMP引物进行LAMP反应，LAMP反应体系为25uL，反应体系包括0.2mmol/L的F3和B3，1.6mmol/L的FIP和BIP，BstDNA聚合酶为8U，DNA模板50～100ng，12.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜宜新，石妞妞，阮宏椿，陈福如，甘林，杨秀娟，代玉立，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35