利用Ｄ－氨基酸的选择性植物生长制造技术

本发明专利技术涉及表达异源Ｄ－氨基酸代谢酶并且因此可利用Ｄ－氨基酸作为氮源的植物和植物细胞。提供了应用Ｄ－氨基酸选择性调控此类植物的生长和逆境耐性的方法和手段。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有外源遗传物质的植物细胞、植物组织或维管植物的选择性生长。植物需要大量的氮作为矿质营养素。植物生长，特别是在农业中，通常受到可获得氮量的限制。传统上一直认为植物仅能利用铵和/或硝酸盐作为氮源。这些化合物要么由如有机氮的矿化和共生的原核生物固氮作用的自然过程提供，要么通过施用含有经工业固定的氮的肥料提供。然而最近的研究表明，植物也可以利用某些有机氮化合物以及无机氮(Nholm，T.等(1998)，Nature，392914-916；Nholm，T.等，(2000)，Ecology，811155-1161；Nholm，T.和Persson，J.(2001)，Physiol Plant，111419-426；Lipson，D.和Nholm，T.(2001)，Oecologia 128305-316)。特别是，从土壤中吸收和代谢氨基酸似乎是植物的普遍特征。在所有用作构建蛋白质的氨基酸中，发现除一种氨基酸(甘氨酸)外所有的氨基酸均具有两种异构体形式，这两种异构体利用其旋转偏振光的能力进行区分。自然界中使光左旋的异构体的量最多，并将其命名为L-或左旋的，而较少见的异构体形式命名为D-或右旋的。虽然在自然界中存在D-氨基酸，但它们仅以极低的浓度存在，并且仅存在于如细菌细胞壁蛋白质的特定化合物中(如在化合物肽葡聚糖中)。尽管植物氨基酸转运蛋白介导D-和L-两种形式的氨基酸的运输(Soldal，T.和Nissen，P.(1978)，Physiol.Plant.43181-188，Boorer，K.J.等.1996.J.Biol.Chem 2712213-2220，Montamat等，1999，Plant Mol.Biol.41259-268)，但是植物缺乏将D-氨基酸转换成在可用于植物体内合成反应的氮形式所必需的酶。因此植物不能利用D-氨基酸作为氮源。然而细菌、真菌和动物中普遍存在着代谢D-氨基酸的能力。导致生物体内D-氨基酸分解代谢的几种反应已得到描述(参见图2)(Friedman，M(1999)J.Agric.Food Chem.473457-3479，Pilone，M.S.(2000)CMLS 571732-1747，Yurimoto等，(2000)Yeast 16(13)1217-1227)。本专利技术者已经发现，表达编码代谢D-氨基酸的酶的异源基因的植物能够利用该D-氨基酸作为氮源，并能够在不能使野生型植物生长的培养基上生长。通常，仅需要一种D-氨基酸代谢酶即可将D-氨基酸转换成可参与普通植物氮代谢路径的化合物(即非右旋化合物)。例如，可应用D-丝氨酸脱水酶将D-丝氨酸转换成氨、丙酮酸和水，可应用D-氨基酸氧化酶将D-氨基酸转换成氨、酮酸(由D-氨基酸底物决定)和过氧化氢。因此，组成D-氨基酸的否则无法利用的氮能被酶促转化成植物可易于利用的形式。本专利技术的一个方面是提供了一种包含有编码具D-氨基酸代谢活性的多肽的序列的分离核酸，该序列可操作地连接到一种或多种植物特异的调节元件。在本专利技术的一些实施方案中，分离核酸可由编码具有D-氨基酸代谢活性的多肽的序列和一种或多种与该序列可操作地连接的植物特异的调节元件组成。在一些实施方案中，D-氨基酸可用作选择性标记。上述的分离核酸可进一步包含编码目的多肽的异源核酸序列。例如，该多肽的表达可以有利方式改变植物的表型或产生其它有利的影响。具有D-氨基酸代谢活性的多肽的表达允许包含该异源核酸序列的转化株的有效筛选，如此处所描述的。具有D-氨基酸代谢活性的多肽意指这样的多肽，所述多肽将D-氨基酸底物转化成的产物用作内源植物酶的底物(即该底物可由植物进行代谢)。由植物进行代谢的产物包括非右旋化合物，即非手性或L-化合物。因此，D-氨基酸代谢多肽催化D-氨基酸底物向产物的生物化学转化，所述产物如非右旋产物，这些产物可以被植物用作营养源，特别是用作氮源。适宜的D-氨基酸代谢多肽可为真核生物酶，例如来于酵母(例如纤细红酵母(Rhodotorula Gracilis))、真菌或动物的酶，或为原核生物酶，例如来于细菌如大肠杆菌的酶。代谢D-氨基酸的适宜多肽的示例在表1和表2中显示。如上所述，还未报道在植物内发现内源的D-氨基酸代谢活性。用于D-氨基酸代谢多肽的底物可为D-arg、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-asn、D-phe、D-pro、D-ser、D-thr、D-trp、D-tyr或D-val。其它作为D-氨基酸代谢酶的适宜底物包括非蛋白的右旋氨基酸、右旋氨基酸前体及右旋氨基酸衍生物。此类底物仅在由D-氨基酸代谢酶使之转化成适宜的可代谢形式之后才可能被用作植物氮源。适宜的前体包括D-鸟氨酸和D-瓜氨酸。优选地用于D-氨基酸代谢多肽的底物为D-ser，D-asn，D-ala，D-ile，D-glu，D-arg，D-lys，D-his或D-asp中的一种，更优选地为D-ala，D-ile或D-ser。在D-氨基酸中非手性酰胺基团的存在可能导致少量的植物生长，这是由于该基团通常能够由植物代谢并用作氮源。例如，在含D-gln的培养基上，内源的谷氨酸合成酶作用于非手性酰胺基团并产生D-glu。因为该非手性活性的产物是其它的自身不能被内源的植物酶代谢的D-氨基化合物，利用这些D-氨基酸生长的生长速率很低，尽管一些氮是可用的。D-氨基酸代谢多肽可为如氧化酶、消旋酶、脱羧酶、转氨酶、脱水酶(也称作氨裂解酶)。氧化酶催化D-氨基酸转化成NH4+、酮酸(取决于D-氨基酸底物)和H2O2(参见图2)。消旋酶将D-氨基酸转化成相应的L-氨基酸形式。L-氨基酸可用作植物氮源。脱羧酶将D-氨基酸转化成可由植物代谢的γ-氨基酸。转氨酶将D-氨基酸转化成不同的L或D氨基酸形式。L-氨基酸能直接被代谢，而D-氨基酸则需进一步转化成可代谢的形式。脱水酶催化D-氨基酸转化成NH4+、酮酸(取决于D-氨基酸底物)和H2O(参见图2)。适宜的氧化酶、消旋酶、脱羧酶、转氨酶和脱水酶的示例在表1和表2中显示。在优选的实施方案中，D-氨基酸代谢多肽为脱水酶，例如D-ser氨裂解酶(以前称作D-ser脱水酶)，或为氧化酶，如D-氨基酸氧化酶。采用常规技术，技术人员能够容易地确定多肽是否具有D-氨基酸代谢活性(即其为D-氨基酸代谢酶)，如上所述。适宜的D-氨基酸代谢多肽也包括该多肽的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因，所述多肽在表1和表2进行示例。适宜的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因保留了D-氨基酸代谢多肽的功能特性，即其催化D-氨基酸底物转化成植物可代谢形式的反应。产生突变体、变体或衍生物的序列变化可为核酸中一处或多处一个或多个核苷酸的添加、插入、缺失或替换，导致所编码多肽中出现一个或多个氨基酸的添加、插入、缺失或替换。当然，也包括不使所编码氨基酸的序列发生变化的核酸改变。代谢D-氨基酸底物的多肽可包含与表1或表2中所示序列的同一性大于约30％、大于约35％、大于约40％、大于约45％、大于约55％、大于约65％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％的氨基酸序列。该序列与表1或表2本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的核酸，其包含编码具有Ｄ－氨基酸代谢活性的多肽的核苷酸序列，所述序列被可操作地连接至植物特异的调控元件。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T内斯霍尔姆，O埃里克松，M赫茨贝里，
申请(专利权)人：巴斯福植物科学有限公司，瑞典植物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]