一种或多种氨基酸的水平增加的植物制造技术

本发明专利技术提供了如下ＤＮＡ构建体，所述ＤＮＡ构建体包含编码苏氨酸脱氨酶和／或ＡＨＡＳ的外源多核苷酸。本发明专利技术还提供了用所述构建体转化过的转基因植物，以及从上述植物获得的种子和后代。所述转基因植物较之同样物种的非转基因植物，一种或多种氨基酸的水平有所增加。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术要求以2003年5月7日提交的美国临时申请No.60/468,727作为优先权，在此通过引用的方式将该申请包括于本文内。本专利技术的领域是农业生物技术。更具体地，本专利技术涉及增加植物内氨基酸水平的生物技术方法。很多种重要的作物，包括大豆和玉米，都没有含有足够数量或达到正确平衡的使得营养完善的若干种氨基酸。对于带支链的氨基酸(Branched Chained amino acids，BCAA)亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸来说尤其如是。BCAA是必要的氨基酸，因为人类不能合成这些分子，因此必须从膳食中获取。异亮氨酸是合成自苏氨酸的带支链氨基酸。苏氨酸自身又是从天冬氨酸合成来的。天冬氨酸和BCAA之间的合成路径涉及到若干种酶，所述的酶受到若干种氨基酸的变构抑制。在对BCAA的合成中使用的酶包括天冬氨酸激酶(AK)、双功能天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶(AK-HSDH)、异丙基苹果酸合酶、苏氨酸脱氨酶(TD)以及乙酰羟酸合酶(AHAS)。具体而言，苏氨酸脱氨酶(EC 4.2.1.16)(TD，苏氨酸脱水酶；L-苏氨酸水解酶(脱氨基))和乙酰羟酸合酶(AHAS；乙酰乳酸合酶(EC 4.1.3.18))是BCAA生物合成过程中的关键酶。在E.coli中，苏氨酸脱氨酶以单独的生物合成形式和生物降解形式存在。苏氨酸脱氨酶的生物合成形式是基因ilvA编码的，其催化植物和微生物中带支链氨基酸生物合成过程的第一个关键步骤。该步骤使L-苏氨酸脱水脱氨，利用吡哆醛5′-磷酸(PryP)产生2-氧丁酸。生物合成形式的苏氨酸脱氨酶受到通过L-异亮氨酸进行的变构调节(Umbarger，Science，123848(1956)；Umbarger，Protein Science，11392(1992)；Changeux，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，26313(1961)；Monod et al.，J.Mol.Biol.，6306(1963))。若干种被去调节的苏氨酸脱氨酶在植物和细菌中都存在。见，Feldberg et al.，Eur.J.Biochem.，21438-446(1971)；Mourad et al.，Plant Phys.，10743-52(1995)；Fisher et al.，J.Bact.，1756605-6613(1993)；Taillonet al.，Gene，63245-252(1988)；Mckel et al.，Mol.Microbiol.，13833-842(1994)；Guillouet et al.，Appl Environ Microbiol.，653100-3107(1999)；Slater et al.，Nature Biotechnology，71011-1016(1999)。与生物合成形式相反，苏氨酸脱氨酶的生物降解形式会被AMP激活，其对L-异亮氨酸的反馈调控不敏感，其在含有高浓度氨基酸并且不含葡萄糖的培养基中以无氧方式产生。此外，在E.coli中，苏氨酸脱氨酶的生物降解形式由单独的基因(tdcB)编码。AHAS酶在大量生物中都是保守的，例如，细菌、酵母和植物(Singhet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，884572-4576(1991))。在E.coli和其它肠细菌中，AHAS是由分别被称为ilvG和ilvM的两个大亚基和两个小亚基组成的异源四聚体蛋白质(Weinstock et al.，J.Bacteriol.，1745560-6(1992))。该四聚体的全部酶活性都由大亚基提供。小亚基是酶的稳定性和调控目的所需要的。在植物中，不同物种间的聚集情况是不同的。在一些植物中，例如Arabidopsis thaliana，AHAS酶是由单一结构基因编码的(Andersson et al.，Plant Cell Reports，22261-267(2003))，而在其它植物种中，例如烟草中，可能就有不止一个功能基因。和细菌一样，植物的AHAS酶也是受到反馈抑制的。植物的AHAS酶是一些商业除草剂的目标(U.S.专利6,727,414)。在对作为一方面的亮氨酸和缬氨酸以及作为另一方面的异亮氨酸的水平进行平衡的方面，AHAS发挥着重要的作用。AHAS对于驱动丙酮酸向乙酰乳酸的转化是很重要的，乙酰乳酸是亮氨酸和缬氨酸的前体。AHAS还驱动2-氧丁酸向乙酰羟基丁酸的转化，后者是异亮氨酸的前体。因为AHAS对于2-氧丁酸的底物优先性高于丙酮酸，故而酶反应优先进行异亮氨酸的生产。异亮氨酸的水平会受到异亮氨酸对TD的反馈抑制的控制，而AHAS受缬氨酸和亮氨酸的反馈抑制。亮氨酸的生产还受异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制。BCAA的商业化生产可以通过直接从蛋白质水解产物中提取氨基酸来进行。例如，异亮氨酸现在的生产水平小于每年400公吨，而对于异亮氨酸的需求却在持续增长。因此，为弥补经过分离的BCAA的短缺，以及提供其更为经济的来源，人们需要对植物进行工程改造，以使氨基酸合成水平提高。
技术实现思路
本专利技术包括一种DNA构建体，所述构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS的外源多核苷酸可操作地连接。在一种实施方式中，本专利技术的DNA构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含AHAS的大亚基，第三个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS小亚基的外源多核苷酸可操作地连接。在一种实施方式中，启动子中的每个都是种子增强型(seedenhanced)启动子。在另一种实施方式中，启动子中的每个都选自以下所构成的组napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP 88、增强的USP 88、Arcelin 5和Oleosin。在一种实施方式中，至少有两种不同的种子增强型启动子。在本专利技术的一个方面，第一个盒包含编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的多核苷酸，其包含SEQ ID NO22。在一种实施方式中，该多核苷酸是SEQ ID NO22。在本专利技术的另一个方面，第一个盒包含编码苏氨酸脱氨酶变异等位基因(variant allele)或其亚基的外源多核苷酸，所述变异等位基因或其亚基包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。在本专利技术的又一个方面，编码苏氨酸脱氨酶变异等位基因的多核苷酸包含SEQ ID NO2。在本专利技术的又一个方面，该多核苷酸是SEQ ID NO2。在本专利技术的一种实施方式中，第一个盒还包含编码质体转运肽的多核苷酸，其与编码苏氨酸脱氨酶、苏氨酸脱氨酶变异等位基因或其亚基的多核苷酸可操作地连接。在另一种实施方式中，第二个表达盒包含编码AHAS大亚基的多核苷酸。在一种实施方式中，编码AHAS大亚基的多核苷酸包含SEQ IDNO16。在一种实施方式中，该本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ构建体，所述构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，该启动子与编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，该启动子与编码ＡＨＡＳ的外源多核苷酸可操作地连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：LM韦弗，TA米特斯基，WD拉普，KJ格鲁伊斯，J梁，G瓦杜瓦，
申请(专利权)人：雷尼森有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]