祖细胞的选择和增殖制造技术

本发明专利技术涉及祖细胞群及获得和培养祖细胞的方法。本发明专利技术方法和组合物可用于包括再生医学（组织再生）、移植和癌症研究的领域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及祖细胞选择、增殖和使用方法。更具体地说，本专利技术涉及用于体外产生祖细胞群的方法和组合物。
技术介绍
成体干细胞和胚胎干细胞由于其在细胞治疗中的潜在作用受到科学界的强烈关注。一种有前景的干细胞源是成熟器官中天然存在的干细胞和祖细胞。然而，由于选择性培养相关的困难，限制了实质祖细胞的使用。例如，在建立来自成人胰或成人胰岛组织的祖细胞培养物中遇到的主要问题是污染性非实质细胞类型的过度生长和分化一定型细胞的继续存在。培养胰岛祖细胞作为胰岛素依赖型糖尿病的潜在治疗手段是特别感兴趣的。已尝试在含血清培养基中培养来源于分离的胰组织的胰岛细胞。然而，大多数连续增殖的胰岛细胞群仅显示适度的增殖能力且保留分化特性。胚胎来源的祖细胞，在牛脑提取物的帮助下增殖，不仅产生胰岛细胞，而且产生腺泡细胞和导管细胞的细胞群，与胰岛前体相比，它可能代表早期胚胎胰祖细胞。而且，本方法使用天然高祖细胞数量的胚胎来源的细胞，而在成熟组织中鉴定和控制祖细胞更难。描述了能够体内产生胰岛素的胰岛细胞群。虽然本方法使胰岛前体细胞一定程度的增殖，但该细胞需要伴随的不同组织类型的间质或“抚育”细胞如导管细胞的共增殖，而导管细胞代表是培养基中的大多数细胞。已使用(例如)细胞标记物的可选择的机械分离方法，以选择干细胞或祖细胞群。然而，这种人为细胞选择仅得到暂时富含的干细胞和祖细胞群。在为寻求得到含再生组分的增殖上皮细胞群，没有研究可区分祖细胞及其天然后代，过渡放大细胞。因此，先前的方法不利于维持祖细胞库通过过渡放大过度生长。过渡放大细胞具有能够连续传代的生长能力，但它们天然抑制干细胞活化和祖细胞继续增殖(Hardin-Young等，Current Neurovascular Research1，(2004)；Parenteau，Encyclopedia of Animal and Plant Cell Technology，365-78(1999))。控制过渡放大细胞的产生和生长或控制污染细胞类型的生存的同时不能维持祖细胞活化和生长，阻止了基本上纯的成人祖细胞群的发育和维持。这一困难导致在实践人上皮细胞培养物中经历的变异。因此，需要一种产生大多数细胞是体外能够延长扩展、体内具有高保真度器官再生的实质祖细胞的细胞培养物的方法。此外，需要一种产生这种来自成熟(成人或新生儿)组织，尤其是实质性组织的方法。专利技术概述本专利技术提供选择和扩展来自新生儿或成人实质性组织的祖细胞群的方法。本专利技术培养的祖细胞群是一种容易获得的细胞来源，体内移植时，它可用于增加、修复、恢复或代替患病、损伤、缺失或损害的组织或器官。本专利技术方法提供促进真祖细胞的选择的培养条件。根据本专利技术，选择损害更分化(more differentiated cell)细胞的细胞培养条件，因而解除更分化细胞通常对祖细胞生长的抑制作用。结果使得构成大多数细胞培养物的自支持、未分化祖细胞的集落形成。本专利技术考虑在细胞培养中可诱导应激反应的任何无血清的培养条件，以抑制更分化细胞的增殖而使祖细胞生长。理想地，选择条件以使一旦产生祖细胞群即可诱导组织特异性分化，体外或体内。虽然考虑了促进祖细胞生长的任何一组培养条件，优选的增殖祖细胞的方法包括在正在分化和/或分化的细胞中诱导凋亡或坏死的无血清培养基。可将细胞先培养在含有低水平或不含钙和/或生长因子的严格的原代培养基中，以使培养朝祖细胞活化和生长偏移。祖细胞开始生长后，祖细胞扩展成为大多数细胞群，细胞在比原代培养基较不严格的第二代最小生长培养基中增殖。最后，在特定生长因子的存在下，通过在第三代培养基中加入分化因子，可促进所得祖细胞培养物的分化。或者，分化前收集祖细胞供使用。考虑抑制分化细胞生长的任何培养基成分，作为产生本专利技术祖细胞群的方法。降低生长因子的浓度和/或效力是达到此目的的一种方法。抑制细胞粘附是另一种方法。然而，本领域已知其它方法，例如降低某些通常促进分化细胞生长的离子的浓度、抑制细胞粘附、改变培养pH等。当然，可采用任何这种独立技术的组合。在优选的实施例中，本专利技术方法包括在无血清培养基中提供含有祖细胞和至少一种正在分化细胞及分化细胞的原代细胞培养物；在原代细胞培养物中诱导应激反应，使祖细胞复制并抑制至少一种正在分化细胞和分化细胞的增殖；鉴定复制所得祖细胞群，它构成原代细胞培养物的大多数细胞。方法可包括从原代细胞培养物中分离祖细胞并培养分离的祖细胞的步骤，以提供次生细胞培养至不少于5个连续代。可在含有谷胱甘肽，例如0.01-10mM谷胱甘肽的合成培养基中维持次生细胞培养。方法还可包括刺激祖细胞群分化的步骤。在优选的实施例中，当次生细胞培养约为60％-75％融合时，可进行连续传代。可在基质组分如胶原的存在下，维持原代细胞培养物或次生细胞培养。优选的应激反应包括在细胞培养物中诱导凋亡和/或坏死。并且，优选的原代培养基基本上不含生长因子或器官提取物，没有或低水平的钙。可使用任何细胞类型产生原代培养物，但优选上皮细胞，例如胰细胞、肝细胞和表皮细胞。一种优选的方法产生包含至少约60数量％、70数量％或80数量％祖细胞的细胞群。培养细胞一段时间，足以产生祖细胞群。通过改变培养条件，例如增加分化因子，在培养中完成分化细胞的刺激，以朝形成分化细胞偏移。本专利技术提供从非胎(non-fetal)组织体外增殖的基本上纯的哺乳动物祖细胞群。本专利技术其它方法包括通过根据方法体外培养胰岛祖细胞；并将祖细胞移植入哺乳动物，防止或治疗糖尿病。由下面的描述和附图可更全面地理解本专利技术的上述和其它特征和优点以及专利技术本身。附图简要说明附图说明图1说明涉及实质产生和使用祖细胞库的新生方法。附图不一定按比例，而是通常重点在于说明本专利技术的原理。结合附图参考说明，将更好地理解本专利技术的优点。专利技术详述本专利技术(部分)提供得到能够体外自持和延长扩展和体内器官再生的实质祖细胞群及所得组合物的方法。该方法包括在不能支持更分化细胞的维持，仍允许下面的祖细胞群生长和扩展的培养基中培养原代细胞。结果是祖细胞构成大多数，优选较高百分比，例如60、70或80数量％的细胞群的培养物。在一个实施例中，细胞培养物是基本上纯或同种祖细胞群。一旦建立，可在确定的条件下将祖细胞群增殖用于多次传代，需要时，可扩展用于临床治疗。本专利技术方法的优点之一是它们提供可用于细胞疗法的容易获得的祖细胞来源。本专利技术祖细胞来源于含能再生的实质细胞的任何器官或组织，包括但不限于，来源于胰、肝、肠、心、肾、角膜、皮肤、视网膜、内耳、骨骼肌、脑或腺的细胞群。在优选的实施例中，祖细胞群产生特定实质谱系的细胞，例如胰岛内分泌细胞谱系、肝细胞谱系或表皮细胞谱系。参考图1，为了达到新生，即从头产生功能组织，本专利技术方法着眼于体外祖细胞群的增殖和活化。在一个实施例中，来源于器官如胰的原代细胞培养物含有多种细胞类型。残留的干细胞10是慢周期细胞，产生祖细胞20。祖细胞20是分化程度最低的细胞，构成负责器官再生的增殖细胞区室。基于发育研究、基因表达和转录因子的表观调节，慢周期干细胞10区别于祖细胞区室和过渡放大细胞30。一旦激活祖细胞20，产生过渡放大细胞30，过渡放大细胞依次产生实质细胞40。过渡放大细胞30是谱系定型的分化细胞并显示有限的复制。实质细胞40是分化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外增殖祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含祖细胞及正在分化的细胞和分化细胞中至少一种的在无血清培养基中的原代细胞培养物；在原代细胞培养物中诱导应激反应，其中所述应激反应允许祖细胞复制并抑制所述正在分化的细胞和分 化细胞中至少一种的增殖；和鉴定复制所得祖细胞群，其中所述祖细胞群构成原代细胞培养物中的大多数细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：NL帕伦特诺，
申请(专利权)人：器官恢复体系股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]