本发明专利技术公开猪白细胞介素－２基因抗感染ＤＮＡ制剂的制备及应用技术。用离子交联法制备质粒壳聚糖纳米颗粒，将猪白细胞介素－２基因真核质粒（ＶＰＩＬ２）溶解于三聚磷酸盐溶液与分子量１５００００，脱乙酰度９５％以上的壳聚糖醋酸溶液５０℃水浴分别恒温２０ｍｉｎ，然后按适当比例均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液５ｍｉｎ，得到ＶＰＩＬ２质粒壳聚糖纳米颗粒液，粒径４０－６０ｎｍ，Ｚｅｔａ电位＋２５．６ｍｖ，无细胞毒性，能抵抗核酸酶对ＤＮＡ的降解。以壳聚糖纳米颗粒包装ＶＰＩＬ２质粒，将此ＤＮＡ纳米颗粒制剂以肌肉注射的方式单独或协同疫苗免疫实验动物，可显著提高试验动物的细胞和体液免疫应答水平，明显增强试验动物的抗感染免疫保护力，提供了壳聚糖纳米颗粒包装ＶＰＩＬ２质粒作为新型动物抗感染分子免疫增强剂的应用技术。
【技术实现步骤摘要】
1.生物技术 2.分子免疫学具体包括猪白细胞介素-2基因真核表达质粒的构建、壳聚糖纳米颗粒对藏猪白细胞介素-2基因真核表达质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的应用技术。
技术介绍
白细胞介素-2(IL-2)是细胞因子网络中关键性的细胞因子，主要由辅助T细胞、NK细胞和LAK细胞分泌；它能激活并促进T细胞、NK细胞、B细胞的分化成熟，诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)活性，还能促进许多淋巴因子如干扰素，肿瘤坏死因子等的合成与释放以及抗体生成，显著增强机体免疫功能。IL-2已用于预防和治疗一些常规方法难以治疗的，如肿瘤、病毒感染等免疫抑制、免疫机能低下的疾病，如恶性黑色素瘤及肾细胞癌，其他肿瘤有神经胶质瘤、膀胱、卵巢肿瘤，视神经细胞癌、肺、头颈部、乳腺肿瘤、淋巴瘤、结肠癌及内皮癌等(Baigrie RJ，1992)。在兽医方面因其能提高疫苗的免疫效果，尤其是在基因工程亚单位苗的免疫效果而倍受重视，展现出广阔的应用前景。IL-2跟IL-2R结合后才发挥作用，它与活化T细胞表面的IL-2Rα链、β链和γ链结合。首先β链和γ链结合成中等亲和力受体，再与低亲和力的α链受体结合，成为高亲和力受体。IL-2与三聚体结合后，发生信号传导，引起NK细胞与单核细胞的增殖反应及活化CTL。其中的信号传导机制尚不清楚，可能与一种酪氨酸激酶的激活相关。另外，IL-2Rα链易从细胞上脱落成可溶性IL-2Rα，可与细胞表面IL-2受体竞争型IL-2，对IL-2的生物学活性发挥起抑制作用。IL-2的主要生物学活性包括1刺激T细胞生长IL-2最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖(从G0期进入S期)和分化。IL-2对T细胞的作用还包括增强CTL的细胞毒活性，增加细胞内pH，促进细胞移动，增强细胞间的接触和诱导细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL4、TNF和CSF等)。2诱导细胞毒作用(1)接受了抗原预刺激信号的CD8+T细胞可以受IL-2的作用活化CTL，发挥细胞毒作用；在一定条件下，CD4+T细胞也可受IL-2的诱导而具有杀伤作用。(2)NK细胞是唯一正常情况下表达IL-2R的淋巴细胞，因此始终对IL-2保持反应性。然而静止NK细胞上只表达IL-2R的β链和γ链，对IL-2的亲和力低，只能对高浓度的IL-2发生反应。一旦NK细胞活化，就表达IL-2R的α链，成为高亲和力的受体；大剂量IL-2诱导的LAK活性主要来源于NK细胞。(3)使T细胞和NK细胞产生IFNγ、TNFβ和TGFβ等因子，促进非特异性细胞毒性；还可诱导产生某些B细胞生长因子以及造血因子等，从而发挥相应的生物学作用。3对B细胞的作用IL-2对B细胞的生长及分化均有一定的促进作用。较高浓度的IL-2可诱导B细胞生长繁殖，促使抗体分泌，并诱使B细胞由分泌IgM向着分泌IgG2转换。IL-2除了支持B细胞生长外，还能促进免疫球蛋白(IgM和IgG)的分泌，诱导J链合成从而加速IgM的装配和分泌。4对巨噬细胞的作用高剂量的IL-2能激活单核巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的作用。单核-巨噬细胞受到IL-2的持续作用后，其抗原递呈能力、杀菌力、细胞毒性均明显增强，分泌某些细胞因子的能力也得到加强。IL-2还能诱导NK细胞增殖，增强NK细胞的活性，诱导LAK细胞和TIL，并刺激它们产生细胞因子。现在IL-2重组蛋白是应用较广泛的细胞因子免疫增强剂。重组人IL-2能提高伤寒杆菌活苗和荚膜多糖亚单位苗的免疫效果；重组牛IL-2与牛疱疹病毒I型活苗一起使用，血清中中和抗体滴度比单独使用疫苗组提高6倍；用牛疱疹病毒糖蛋白亚单位苗免疫牛，并注射IL-2，可显著提高特异性抗体滴度，特异性细胞毒反应和特异性淋巴细胞增殖反应；重组牛IL-1、IL-2能促进牛病毒性腹泻死苗的免疫效果；IL-2分别于狂犬病疫苗或疟疾疫苗联合使用，对相应抗原的攻击有保护作用。Ramshaw等(1981)、Flexner等(1987)先后报道将小鼠或人IL-2cDNA与含禽流感血凝素(HA)基因的痘病毒重组，获得表达IL-2的重组病毒。将这种重组病毒与不含IL-2基因的痘病毒同时接种裸鼠，结果显示，IL-2的插入并不影响HA的表达水平及免疫原性，但可以提高裸鼠的抗病力。Hazama等(Hazama et al.，1993)将IL-2基因与牛单纯性疱疹病毒糖蛋白D基因融合，真核细胞内表达融合蛋白，免疫小鼠后攻毒。结果该融合蛋白可以完全保护小鼠免疫病毒攻击，而以氢氧化铝为佐剂但不含IL-2的重组糖蛋白只产生部分保护，IL-2在体内的半衰期也因此延长大约4倍。这些结果表明采用此种方式获得，是研制新一代基因工程苗的另一途径。rIL-2能显著增强人体免疫功能，只要每天注射10μg-100μg的rIL-2，四周后，NK细胞的高亲和受体即可从10％升至60-80％，能大大增强其免疫功能(Akuffo H，Kaplan G，etal.1990)，说明rIL-2是良好的免疫治疗因子，对维持人体正常健康以及防病治病有重要的作用。用逆转录病毒载体插入IL-2基因，再转化肝癌细胞株HAC，从而使之能持续分泌IL-2。将此IL-2基因转化了的HAC去接种大鼠腹腔或皮下，结果使动物生存期延长，田体积缩小，这些实验结果，说明IL-2的基因治疗在动物模型实验中取得了明显的效果(王立群，郑仲承，1996)。rIL-2对感染性疾病有较好的治疗作用。rIL-2对麻疯病的治疗有很好的疗效，每天注射两次，每次10μg，经8天的疗效，可相当于WHO使用MDT一年的疗效；有人发现，rIL-2对结核杆菌(TB)有很强的抑制作用，对小鼠接种TB5或15天后，每天肌肉注射0.5-1.0万IU的rIL-2共10天，然后观察脾脏中TB细菌数目，结果rIL-2对TB的抑制作用能达到99％(Flexner C，Hugin A，et al，1987)；近年来性病有蔓延趋势，尖锐湿疣过去在性病中居第4位，现在上海的统计上升到第二位，它是由乳头状瘤病毒感染所致，可用激光治疗，但复发率高达30-60％，用rIL-2合剂肌肉注射与激光治疗相结合，可完全防止复发，疗效几乎100％。对AIDS病患者，使用低剂量rIL-2(10万IU/天)，治疗一个月，也获得一定的效果。rIL-2对严重结合免疫缺陷症(SCID)也有一定疗效(McElrach MJ，et al，1990)。以上rIL-2的治疗作用，均由于rIL-2增强免疫功能所致，也证明用小剂量rIL-2能增强免疫功能，可产生良好的疗效。rIL-2对肿瘤有较强的治疗作用。肌注rIL-2能增强癌症患者的免疫功能。在rIL-2的临床癌症患者中，大部份患者的免疫功能经rIL-2治疗而增强，rIL-2的这种免疫功能对防止癌症患者在手术、放化疗后的复发，转移而延长病人生命，有一定的作用。rIL-2与LAK合用治疗癌症，两者疗效均达50％，采用局部动脉灌注rIL-2及异体LAK，治疗肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌共268人，灌注682例次，总有效率36.5％(肝癌38％)，症状改善率68.3％(肝癌70％以上)。此外，IL-2有明显的镇痛作用。实验结果表明结果IL-2的镇痛作用非常明显(Li JZ，Z本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪白细胞介素－２基因抗感染制剂的制备及应用，其特点为包括猪白细胞介素－２基因真核表达质粒的构建、壳聚糖纳米颗粒对猪白细胞介素－２基因真核表达质粒的分子包装、此ＤＮＡ制剂应用于猪增强机体免疫应答及抗感染免疫力的应用技术。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高荣，武梅，李惠，王泽洲，李江凌，吕学斌，吴凯源，付满良，杨毅，王丽焕，
申请(专利权)人：四川今朝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]
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