一种鸡爪槭内参基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种鸡爪槭内参基因，同时揭露了利用该鸡爪槭内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物，不仅解决了现有鸡爪槭定量PCR检测中没有内参基因的现状；而且所设计的实时荧光定量PCR引物用于鸡爪槭基因表达分析时，能够提高鸡爪槭基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物适用于鸡爪槭不同叶期及不同叶色品种的相关基因定量表达研究，能显著提高所得数据的准确性，为减少不同样本间的误差、使总RNA量标准化、保证数据的可靠性提供技术支撑。

A a.palmatum reference gene and its application

The invention provides a a.palmatum reference gene, and revealed the a.palmatum reference gene as real-time PCR primers based design, not only solves the situation of no reference genes existing Acer palmatum quantitative PCR detection; real-time PCR primers and designed for gene expression analysis of Acer palmatum, can improve Acer palmatum gene analysis research on the stability, reliability and repeatability of the expression; in addition, the expression of genes associated with quantitative real-time PCR primers designed for a.palmatum different leaf stage and different leaf color varieties, can significantly improve the accuracy of the data, in order to reduce the error between the different samples, the total amount of RNA standard provide technical support and guarantee the reliability of the data.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡爪槭内参基因及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种鸡爪槭参基因及其应用，具体地，利用该鸡爪槭参基因的核苷酸序列为基础设计一对荧光定量特异引物。
技术介绍
鸡爪槭(Acerpalmatum)，属槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer)落叶小乔木，是一种观赏价值极高的观叶树种，其枝序整齐，叶形优美，层次分明。鸡爪槭品种甚多，有‘黄金槭’(叶片金黄色)、‘橙之梦’(橙色叶片边缘带淡红色)、‘桂’(叶片黄绿色)、‘蝴蝶舞’(绿色斑叶边缘带粉红色)、‘青枝垂’(叶片绿色)、‘青鸭’(叶片嫩绿色)、‘布加迪’(叶片紫红色)、‘三季红’(叶片深紫红色)、‘笠置山’(叶片砖红色，叶脉红色)、‘女神’(叶片紫红色，叶脉红色)、‘出猩猩’(叶片深红色)等，叶色变化多样，不仅品种间叶色存在差异，叶色季相变化也很丰富，导致鸡爪槭叶色差异的分子机制是近年来科学家们研究的新兴领域。对于鸡爪槭不同叶色品种，叶绿素、花青素、类胡萝卜素的种类和含量是决定其叶色呈现的最主要因素，参与调控这些物质代谢的相关基因的表达试验是研究其叶色差异分子机制的重要手段。实时荧光定量PCR(qPCR)因其精准性和敏感性已成为目前测定植物基因表达水平最常用的方法之一；在qPCR检测中，合适内参基因的选择是其获得准确可靠的试验数据的前提。目前在高等植物qPCR研究中，较为常见的内参基因有18SrRNA、GAPDH、β-Actin和UBQ等。理想的内参基因应该在各种不同的试验条件下均能够保持稳定地表达，然而，一种内参基因不可能适用于所有的反应体系，因此，对于不同的实验体系，筛选合适的内参基因是非常必要的，以减少不同样品在RNA产量、质量以及反转录效率等方面可能存在的差异，提高qPCR的准确性。肌动蛋白(Actin)普遍存在于真核生物中，具有高度的保守性和同源性，并在各种组织中表达相对恒定，因而，常被用作内参基因以研究其他基因的表达模式及调控机制。但有关鸡爪槭Actin内参基因的分离和鉴定研究至今未见报道，在运用实时荧光定量PCR进行鸡爪槭相关基因定量表达研究中，对鸡爪槭不同叶色品种及不同叶期叶片中稳定表达的内参基因的研究也是空白。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种鸡爪槭内参基因，并揭露了利用该鸡爪槭内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种鸡爪槭内参基因，其特征在于：所述内参基因的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；且该内参基因是以黄金槭cDNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的；其中引物对包括：保守区引物：Actin-F：5′-ATGGGnCAGAAGGATGCCTA-3′，Actin–R：5′-TGGAAGGTGCTGAGrGATGC-3′；n＝T或G，r＝G或A；3'RACE顺式特异引物：Actin-3′-1：5′-GGTATTGTTAGCAACTGGGACG-3′，Actin-3′-2：5′-GACCCAGATTATGTTTGAAACTTTC-3′；5'RACE反向特异引物：Actin-5′-1：5′-GAAAGTTTCAAACATAATCTGGGTC-3′，Actin-5′-2：5′-CGTCCCAGTTGCTAACAATACC-3′；及ORF扩增引物：Actin-ORF-F：5′-CCGTCGCGCTTCATCGTCTTT-3′，Actin-ORF-R：5′-CCACCTCAACATTTCTCCACATCAACC-3′。与此同时，揭露了以上述内参基因的核苷酸序列为基础，并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；且该实时荧光定量PCR引物为：Actin–RT-F：5′-GGATGCCTATGTTGGTGACG-3′，Actin–RT-R：5′-AGCACTGGGTGTTCCTCTGG-3′。本专利技术的有益效果在于：提供了一种鸡爪槭内参基因，同时揭露了利用该鸡爪槭内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物，不仅解决了现有鸡爪槭定量PCR检测中没有内参基因的现状；而且所设计的实时荧光定量PCR引物用于鸡爪槭基因表达分析时，能够提高鸡爪槭基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物适用于鸡爪槭不同叶期及不同叶色品种的相关基因定量表达研究，能显著提高所得数据的准确性，为减少不同样本间的误差、使总RNA量标准化、保证数据的可靠性提供技术支撑。【附图说明】下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的描述。图1是本专利技术实施例1中保守区扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。图2是本专利技术实施例1中5'RACE扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。图3是本专利技术实施例1中3'RACE扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。图4是本专利技术实施例1中ORF扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。图5是本专利技术中实施例2的1％的琼脂糖凝胶电泳图。图6是本专利技术中实施例3的溶解曲线图。图7是本专利技术中实施例4的1％的琼脂糖凝胶电泳图之一。图8是本专利技术中实施例4的1％的琼脂糖凝胶电泳图之二。【具体实施方式】本专利技术列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本专利技术的范围，这些实施例仅用于对本专利技术进行说明。且各实施例中所采用的仪器与试剂如下：RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，实验所用的高保真酶等试剂及反转录、凝胶回收、质粒提取等试剂盒均购自TaKaRa公司，大肠杆菌DH5α等菌株由本实验室保存，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序由上海铂尚生物公司完成，其余生化试剂均为国产分析纯。实施例1内参基因的获得先进行RNA提取，具体地：采用通用植物总RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，具体地：称取0.2g‘黄金槭’呈色期叶片于研钵中，加入液氮后快速研磨至粉末状，将粉末移至1.5mLRNasefree离心管中，加入1mL裂解液PL混匀，65℃条件下孵育5min，而后在4℃、12000rpm条件下离心10min；取上清液转入到RNasefree过滤柱中，4℃、10000rpm条件下离心1min，收集下滤液于收集管中，并加入1倍体积的70％乙醇，混匀；将混匀后得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱RA中，4℃、12000rmp条件下离心1min，弃掉废液，将吸附柱套回收集管；加入500uL去蛋白液RE，4℃、12000rmp条件下离心1min，弃掉废液；加入700uL漂洗液RW，4℃、12000rmp条件下离心1min，弃掉废液；加入500uL漂洗液RW，4℃、12000rmp条件下离心1min，弃掉废液；将吸附柱RA放回空收集管中，4℃、12000rmp条件下离心2min；取出吸附柱RA，放入另一个RNasefree离心管中，在吸附膜的中间部位加入50uLRNasefreewater，室温放置2min，4℃、12000rmp条件下离心1min，得到样品RNA。接着进行保守区扩增、3'RACE以及开放阅读框(ORF)验证，这些过程中所用的cDNA的合成都是采用PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒(TaKaRa)进行，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡爪槭内参基因，其特征在于：所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；且该内参基因是以黄金槭cDNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的；其中引物对包括：保守区引物：Actin‑F：5′‑ATGGGnCAGAAGGATGCCTA‑3′，Actin–R：5′‑TGGAAGGTGCTGAGrGATGC‑3′；n＝T或G，r＝G或A；3'RACE顺式特异引物：Actin‑3′‑1：5′‑GGTATTGTTAGCAACTGGGACG‑3′，Actin‑3′‑2：5′‑GACCCAGATTATGTTTGAAACTTTC‑3′；5'RACE反向特异引物：Actin‑5′‑1：5′‑GAAAGTTTCAAACATAATCTGGGTC‑3′，Actin‑5′‑2：5′‑CGTCCCAGTTGCTAACAATACC‑3′；及ORF扩增引物：Actin‑ORF‑F：5′‑CCGTCGCGCTTCATCGTCTTT‑3′，Actin‑ORF‑R：5′‑CCACCTCAACATTTCTCCACATCAACC‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种鸡爪槭内参基因，其特征在于：所述内参基因的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；且该内参基因是以黄金槭cDNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的；其中引物对包括：保守区引物：Actin-F：5′-ATGGGnCAGAAGGATGCCTA-3′，Actin–R：5′-TGGAAGGTGCTGAGrGATGC-3′；n＝T或G，r＝G或A；3'RACE顺式特异引物：Actin-3′-1：5′-GGTATTGTTAGCAACTGGGACG-3′，Actin-3′-2：5′-GACCCAGATTATGTTTGAAACTTTC-3′；5'RACE反向特异引物：Actin-5′-1：5′-GAAAGTTTCAAACATAATCTGGGTC-3′，...

【专利技术属性】
技术研发人员：林榕燕，钟淮钦，陈裕德，林兵，罗远华，
申请(专利权)人：福建省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35