本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一系列ｐｏｌｙＡ ＲＮＡ分子的设计与制备，以及抑制外源基因表达的应用。本发明专利技术体外转录制备单链ｐｏｌｙＡ分子，通过脂质体包裹的方式将ｐｏｌｙＡ分子与外源基因表达载体共转染导入细胞，能有效抑制外源基因的表达，而对内源稳定表达基因无明显效果。本发明专利技术在生物医学领域具有广泛应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程
，涉及一定长度的polyA分子的制备方法和该类polyA分子在抑制外源基因表达中的作用。
技术介绍
真核生物mRNA的3’端通常都有20-200个腺苷酸残基，构成多聚腺苷酸的尾部结构，即polyA尾巴。高等真核生物中RNA聚合酶II转录终止发生在成熟转录本的3’端下游几千碱基之后，其精确机制目前还不清楚；而后3’端通过内切，在高度保守的多腺苷酸化位点(AAUAAA)后10-30碱基位点处加上不同数量的腺嘌呤，形成polyA尾巴。核内hnRNA3’端也有polyA结构，并且比mRNA略长，平均长度为150-200个核苷酸，这表明了RNA转录后修饰的加尾过程早在核内已经完成。这种polyA加尾的功能也不很明确，但可以从以下几方面得到启示1)多聚腺苷酸化可被类似物3’-脱氧腺苷所阻止。这种阻止作用并不影响核hnRNA的转录，但可阻止细胞质中出现新的mRNA。这表明多聚腺苷酸化对mRNA成熟是必要的。2)珠蛋白mRNA上的polyA尾巴被去除后，仍然能在麦胚无细胞系统中翻译，显示该尾部结构并不是翻译必需；然而去除polyA尾巴后的mRNA稳定性明显降低，翻译效率下降。当mRNA由细胞核转移到细胞质中时，polyA尾巴常有不同长度的缩短。由此可见，polyA尾巴至少起着某种缓冲作用，防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解作用。3)polyA尾巴与相关蛋白的结合促进mRNA由核向质的转移。mRNA进入细胞质后，polyA尾巴的“命运问题”更是缺乏明确的解释。polyA准确的以何种方式降解，是单个腺嘌呤逐一去除，还是随机去除？那么细胞质中是否存在不同长度的polyA片断分子？我们结合相关研究进展和自身工作基础，涉及并合成了不同长度的polyA RNA分子，依靠脂质体转染入细胞中，得到了polyA RNA分子在外源基因表达调控相关信息，并实施于抑制外源基因表达的应用中。
技术实现思路
本专利技术目的在于提出一定长度单链polyA RNA分子的制备，并提出该类polyARNA分子在抑制外源基因表达中的作用。本专利技术通过以下技术方案实现首先设计带有T7转录启动子的polyA的DNA转录模板，经体外转录纯化后获得polyA RNA分子。然后采用脂质体包裹的方法将polyA与表达相应外源基因的真核载体共转染入细胞。48小时后，观察和检测对照组与实验组的外源基因蛋白质表达水平和mRNA转录水平。本专利技术涉及的polyA长度为10-100个连续的A。本专利技术阐述了当polyA长度达到60时，明显抑制外源基因的表达，而对于内源稳定表达基因无明显影响。这种特性使得单链polyA RNA分子在生物医学中具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。附图说明图1不同长度polyA分子电泳图1.10A 2.20A 3.30A 4.40A 5.50A 6.60A图2不同长度polyA分子对外源GFP表达影响的荧光观察结果图3不同长度polyA分子对外源GFP的mRNA影响，RT-PCR电泳图1.10A 2.20A3.30A 4.40A 5.50A 6.60A 7.control图4不同长度polyA分子对内源稳定表达GFP的mRNA影响，RT-PCR电泳图1.10A2.20A 3.30A 4.40A 5.50A 6.60A 7.control图5polyA，polyU，polyG，polyC，polyN对外源GFP表达影响的荧光观察结果图6polyA，polyU，polyG，polyC，polyN对外源GFP mRNA影响，RT-PCR电泳图1.polyA2.polyU 3.polyG 4.polyC 5.control具体实施方式以GFP(绿色荧光蛋白)为检测基因，与单链polyA RNA分子共转染来描述本专利技术在抑制外源基因表达中的作用。1、polyA分子以及所用对照RNA分子的DNA的转录模板的设计与合成(见序列表)10A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAAAAAAAAAA3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTTTTTTTTT5′20A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT5′30A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT5′40A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-40A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-40T5′ 50A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-50A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-50T5′60A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60T5′5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-50A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-50T5′100A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-100A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-100T5′60U5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60T3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60A5′60G5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60G3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60C5′60C5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60C3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60G5′60N(N表示随机序列)5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60N3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60n5′将上述相互匹配的单链DNA(1ug/ul)于20ul体系中95℃加热5分钟，37℃放置30分钟退火形成双链DNA。2、制备polyA RNA5×转录缓冲液400mM HEPES-kOH，120mM Mgcl2，10mM spermidine，200mM DTTrNTP25mM each T7RNA聚合酶(10u/ul)，RNAase抑制剂(50u/ul)1)按照下述转录体系进行反应5×转录缓冲液8ulrNTP8ul T7RNA聚合酶3ulDNA模板6ulRNAase抑制剂1ulDEPCH2O14ul37℃，4小时加入4u无RNAase的DNAase，37℃消化30分钟。2)加入1/5体积10M的醋酸铵，2.5倍体积的无水乙醇，于-20℃沉淀1小时。4℃离心回收沉淀，70％乙醇清洗沉淀。3)重复步骤2)一次，用DEPC H2O溶解沉淀，测定A260/A280，定量。2％琼脂糖胶电泳鉴定(图1)3、polyA对外源GFP表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一系列单链ｐｏｌｙＡＲＮＡ分子，其特征在于由１０－１００个连续腺嘌呤核苷酸（Ａ）构成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵宁生，李洁，杨光，沈倍奋，范明，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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