本发明专利技术涉及一种纳米片状氧化钛可逆组装酶的方法，其特征在于，首先用有机胺类剥离层状钛酸盐为单片状纳米溶胶，然后通过控制酶的表面电荷，使之与带负电的氧化钛单层实现交替的组装，实现酶的固定，并且可逆地释放回收载体。本发明专利技术利用高热稳定和化学稳定的氧化钛作为固定酶的载体，来提高酶的生物性能。按需要，产品可以制成颗粒、胶冻及膜等形式，利于保存。这种自组装方法由于酶分子和氧化钛片层充分接触，１克载体具有５．９克血红蛋白的最高负载量。固定后的酶能保留８０％左右的自由酶活性，同时热稳定性和有机溶剂中稳定性都有很大提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是一种用无机层状氧化钛固定酶的通用方法，更确切地说，涉及，属无机化学和纳米材料相关
技术介绍
酶是一类高效、高度专一的生物催化剂。在人类历史上酶很早就得到了应用，而且应用日益广泛。但酶在应用中的致命弱点是稳定性低，且对于高温、有机溶剂或极端的PH极其敏感。这给酶的分离、制备、应用以及回收都带来一定的困难。固定化酶的出现部分克服了这些缺点，为酶的大规模工业应用开辟了新的前景。酶的固定化方法很多，大致可以分为物理方法(如吸附、包埋等)和化学方法(如共价键合、酶交联)等两大类。固定化酶的性能往往取决于固定方法和所用的固体基材。目前通常用来固定酶的材料大多是天然或人工合成的高分子或蛋白质材料。而常见的无机材料如玻璃、矾土、硅藻土、金属、金属氧化物以及各种溶胶凝胶，虽然具有更好的机械强度、热稳定以及耐有机溶剂的破坏性，但它们除部分溶胶凝胶材料外很少被应用在酶等生物活性物方面。这主要是因为这些材料很难形成大比表面的结构，并且表面也很难功能化以结合生物大分子。人们所知，无机层状材料由于具有可调节的层间距特征，所以是一类潜在的固定生物大分子的载体。它固定酶的原理是建立在无机层状材料的层与层之间可以通过弱的静电或氢键来相互作用的，这样就有可能破坏原来的结构而将生物分子引入层中间。最早Kanzaki，Y.等(Bull.Chem.Soc.Jpn.1991，642292)和Ding，Y.等(Chem.Mater.1995，7562)尝试了将生物酶分子直接插入到金属磷酸盐层间。但为实现直接的插层反应，往往需要10多天的反应时间和强酸强碱等极端的反应条件，这些均极易破坏酶本身的活性结构。最近无机层状材料的剥离工艺得到很大发展。通过季铵碱的作用，一系列的无机层状材料都能剥离成纳米片状，材料的厚度为单层或几层的基本层面。通过这种纳米片状材料与客体分子的自组装作用，一系列的功能分子都能在更温和的条件下进入无机层中间。2000年，Kumar，C.V.(J.Am.Chem.Soc.2000，122830)等报道了用上述的间接插层的方法将肌红蛋白、血红蛋白、溶解酵素、胰凝乳蛋白酶和葡萄糖氧化酶都插层入α-磷酸锆层中间。本专利技术者也曾用纳米片状氧化锰来组装肌红蛋白和血红蛋白分子，并通过控制其挥发过程获得不同的形貌。但是以前报道的组装方法所形成的产物是单一的溶胶凝胶，很难制成颗粒或其它形式，并且酶和无机层板的结合是不可调控的，使酶和载体很难循环使用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用纳米片状氧化钛大容量可逆组装酶的方法。固定后的酶能保留大部分自由酶活性，同时提高其耐热性和抗有机溶剂性。本专利技术所述的一种用纳米片状氧化钛大容量可逆组装酶的方法，其特征在于用具有高热稳定、化学稳定、环境友好的氧化钛作为固酶定的载体。首先从在高温下合成的含碱金属离子的层状钛酸盐制备片状的纳米溶胶，然后通过控制酶分子的表面电荷让它和带负电的氧化钛单层实现可逆的组装。所述的用于固定酶的纳米片状氧化钛溶胶是由如下的方法制备首先用过量无机强酸中的质子(如盐酸、硝酸或硫酸)中的质子，交换层状钛酸盐层间的碱金属离子生成固体钛酸，然后用季铵碱参照1∶0.2-1的酸碱比对固体钛酸进行溶胀性剥离，对所得的溶胶在5000-10000rpm下离心分离除去沉淀物，最后用有机弱酸(如醋酸或柠檬酸等)调节溶胶到近中性。所述的通过控制酶的表面电荷实现可逆组装工艺是将1-10倍质量的酶分子与中性氧化钛溶胶在室温搅拌混合，然后加入有机弱酸直到引发沉淀为止，一般结果是溶液的pH值在其等电点附近。然后向所得的混合物沉淀中加入季铵碱使其pH高于酶分子等电点2-3能让形成的复合物重新剥离成胶体混合物。本专利技术具体实施如下先将酶和纳米片状氧化钛溶胶搅拌混合，然后再加入稀释的有机弱酸直到引发沉淀，最后再向产物中加入四丁基氢氧化铵剥离还原胶体复合物。具体工艺过程如图1a.碱金属层状钛酸盐的合成反应物为碱金属碳酸盐与纳米片状二氧化钛，按照精确的配比混合均匀合成化学计量式分别为Cs0.7Ti1.825□0.175O4(□表示空位)和AxTi2-x/3Lix/3O4系列(x＝0.8，A＝K；x＝0.70，A＝Cs)的产物。反应条件800-1200℃下焙烧20小时，冷却至室温并研磨，再重复高温反应一次，并再次室温研磨。b.纳米片状氧化钛溶胶的制备上面所得的碱金属层状钛酸盐与3mol/l盐酸、硝酸或硫酸中一种按照1g/100ml的比例进行反应，时间1-24小时，过滤后重复上述反应几次，用过量的水清洗得到固体钛酸。所得固体钛酸与季铵碱参照0.2-1∶1的酸碱摩尔比混合搅拌，反应1-8天后，将所得的溶胶在5000-10000rpm下离心分离。c.纳米片状氧化钛可逆组装酶酶分子与上面所得的中性纳米片状氧化钛溶胶以1-10∶1的质量比在室温搅拌混合，逐滴加入浓度为1mol/l的有机酸直到引发沉淀生成层状生物复合物。逐滴加入季铵碱使复合物沉淀重新剥离成酶分子和纳米片状氧化钛的胶体混合物。本专利技术提供的纳米片状氧化钛大容量可逆组装酶的工艺方法特点是a.反应条件温和，能最大程度保留酶的活性达80％左右；b.反应过程可控，通过简单的调节酸碱度就能实现酶固定和释放，从而实现载体的循环降低在实际应用中的成本； c.纳米片状氧化钛大的比表面能达到1克载体结合5.9克酶的负载量提高载体利用效率；d.所用氧化钛载体有高热稳定、化学稳定并且环境友好的特性，能保护层间酶抵制热冲击以及其它有机分子的冲击，按需要，产品可以制成颗粒、胶冻或膜的形式，利于保存。附图说明图1为以血红蛋白为例，整个工艺过程的流程图。图2为实施例1中以血红蛋白为选择的模拟过氧化物酶，血红蛋白和氧化钛的反应质量比为4∶1所得层状生物复合物、用四烷基氢氧化铵剥离后的胶体混合物和再次组装的复合物的X-射线衍射图。图3为实施例2中以血红蛋白为选择的模拟过氧化物酶，血红蛋白和氧化钛的反应质量比为6∶1所得层状生物复合物的X-射线衍射图。图4为实施例3中以牛血清白蛋白为选择的生物活性物，牛血清白蛋白和氧化钛的反应质量比为4∶1所得层状生物复合物的X-射线衍射图。具体实施例方式实施例1准确称取碳酸铯5g和二氧化钛6.5g混合并研磨均匀后，800℃下反应20小时，重复反应一次，中间冷却并研磨。取所得的层状钛酸盐Cs0.7Ti1.825□0.175O4(□表示空穴)10g，放入浓度为3mol/l的1000ml盐酸溶液中，室温搅拌24小时，中间换盐酸溶液并重复3次，过滤并用水洗净表面残留酸。取2g固体钛酸加入200ml含3ml 40％四丁基氢氧化铵的水溶液中，室温搅拌8天后，在8000rpm下离心分离后备用。取氧化钛含量为1mg/ml的胶体100ml与400mg血红蛋白混合，用1mol/l醋酸调节pH为6.0左右，引起自组装的产生，生成绛红色沉淀，上层溶液中血红蛋白含量小于0.01mg/ml。用0.005mol/l四丁基氢氧化铵滴定重新悬浮在水中的沉淀到pH8-9能重新形成胶体混合物。以血红蛋白作为模拟过氧化物酶，用双氧水催化愈创木酚的反应作为特征反应，同样反应条件下固定化后的血红蛋白能保持自由血红蛋白反应初速度的71％。热温定性有很大提高，固定化血红蛋白90℃下在0.1mol/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用纳米片状氧化钛可逆组装酶的方法，其特征在于：用二氧化钛作为酶固定的载体，首先从高温合成的含碱金属离子的层状钛酸盐制备片状的纳米溶胶，然后通过控制酶分子的表面电荷让它和带负电的氧化钛单层实现可逆的组装；具体步骤是：ａ．碱金属层状 钛酸盐的合成反应物为碱金属碳酸盐与纳米片状二氧化钛，按照配比混合均匀合成化学计量式分别为Ｃｓ↓［０．７］Ｔｉ↓［１．８２５］□↓［０．１７５］Ｏ↓［４］，□表示空位和Ａ↓［ｘ］Ｔｉ↓［２－ｘ／３］Ｌｉ↓［ｘ／３］Ｏ↓［４］系列ｘ＝０ ．８，Ａ＝Ｋ；ｘ＝０．７０，Ａ＝Ｃｓ的产物，反应条件是８００－１２００℃下焙烧２０小时，冷却至室温并研磨，再重复高温反应一次，并再次室温研磨；ｂ．纳米片状氧化钛溶胶的制备步骤（ａ）所得的碱金属层状钛酸盐与３ｍｏｌ／ｌ无机强酸 按照１ｇ／１００ｍｌ的比例进行反应，反应后经过滤重复上述反应，用过量的水清洗得到固体钛酸，将所得的固体钛酸与季铵碱参照０．２－１∶１的酸碱摩尔比混合搅拌，反应１－８天后，将所得的溶胶离心分离；ｃ．纳米片状氧化钛可逆组装酶酶分 子与步骤（ｂ）所得的中性纳米片状氧化钛溶胶以１－１０∶１的质量比在室温搅拌混合，逐滴加入浓度为１ｍｏｌ／ｌ的有机酸直到引发沉淀生成层状生物复合物。逐滴加入季铵碱使复合物沉淀重新剥离成酶分子和纳米片状氧化钛的胶体混合物。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高秋明，王启刚，
申请(专利权)人：中国科学院上海硅酸盐研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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