野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的核酸序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了野生二粒小麦α－淀粉酶抑制因子的编码基因序列及其氨基酸序列，分别如序列表ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．１和ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．２或ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．３和ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．４或ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．５和ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．６所示，属于生物基因工程技术领域。该基因序列可以通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等本领域工作人员共知的方法导入小麦，培育出抗虫性优良的小麦品种。同时依据克隆得到的基因序列，可以建立特异、便捷的分子标记体系，通过该体系进行定向育种。并且通过依据基因序列，还可以建立含α－淀粉酶抑制因子编码基因的酵母表达载体，在酵母中表达，获得α－淀粉酶抑制因子，作为植物缘杀虫剂添加到普通杀虫剂中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物基因工程
，特别涉及一种小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因的核酸序列，以及基于该序列通过生物技术方法改良小麦抗虫性的应用。
技术介绍
由于受到各种害虫的攻击，每年世界上的粮食会减产37％。化学杀虫剂的深入研究和广泛应用，在生产上取得了显著的防虫效果，但同时化学杀虫剂防治虫害的成本高、对环境污染大、容易使害虫产生抗药性导致生态平衡失调。因此，近年来的研究重点集中在如何提高植物自身的抗虫性，开展了以异源(植物、动物、微生物)抗虫基因导入为目的的育种，以使植物获得抗虫基因。目前，已从不同物种中分离克隆了多种类型的抗虫基因，并导入植物体内而获得转基因抗虫植物。淀粉类的植物种子富含蛋白质、糖、脂质，因此容易受到害虫(特别是象鼻虫)的“攻击”。通常植物本身有一些抵抗害虫掠夺的机制，在某些程度上可以减低害虫的危害，这些机制是在植物长期进化过程中形成的。参与植物自身的防御体系有抗生素、生物碱、萜烯、氰化物和一些蛋白质，而酶抑制因子就是蛋白质类中重要的一种。α-淀粉酶抑制因子是属于糖(苷)水解酶抑制因子，是一个庞大的蛋白质家族，目前在医药和农业上具有广泛的用途。麦类作物种子中富含多种形式的α-淀粉酶抑制因子，能抑制多种来自昆虫和脯乳动物的外缘或内缘α-淀粉酶。部分α-淀粉酶抑制因子只专一针对昆虫淀粉酶作用，因为它们对来源于昆虫的酶有强抑制作用，但是对来源于脯乳动物的唾液淀粉酶和胰淀粉酶作用却很小或者没有。其中分子量为12kDa(0.28family)和24kDa(0.19family)的两个抑制因子家族研究较为透彻。24kDa小麦二聚α-淀粉酶抑制因子(WDAI)是其中一类天然的抗虫蛋白，对某些害虫的α-淀粉酶具有抑制作用，这个蛋白家族中的抑制因子均为124个氨基酸残基的小蛋白质，其中WDAI-0.19和WDAI-0.53两个因子在氨基酸序列上仅有7个位子发生替换，有94％的同源性，但是0.19因子作用范围非常广泛而0.53因子则专一作用与昆虫α-淀粉酶，对同一淀粉酶的抑制活力也存在100倍的差异。Oda等对0.19因子的晶体结构做了详细研究，目前它是谷物α-淀粉酶抑制因子中唯一一个已知3D结构的蛋白因子(PDB ID-code1HSS)。其与脯乳动物、昆虫α-淀粉酶的作用机理也有了深入研究。植物种子和其他器官中的α-淀粉酶抑制因子能有效控制食叶类昆虫的数量，特别是控制高度依赖淀粉作为其能量供体的昆虫。Bt基因抗虫谱十分有限，无法对付western corn rootworm等农作物害虫，因为Cry蛋白无法结合到这种害虫的肠膜上，发挥不了作用。而α-淀粉酶抑制因子对几个目的昆虫均有毒性作用，抗虫谱较广，可以弥补Bt毒蛋白的这一缺憾。虽然大多数害虫可以利用多种不同特性的α-amylases来消化植物淀粉提供自身能量，使得没有特效的α-淀粉酶抑制因子。但是，人们仍然可通过植物基因工程手段利用α-amylase inhibitors控制害虫。1990年Teresa将菜豆中αAI21的基因成功转入两种豆科作物豌豆和豇豆，利用PHA的启动子获得αAI21蛋白的高效表达，转基因植物具有明显的抗虫性。2000年的大豆实验中转基因豌豆的抗虫率将近100％。转基因豌豆中含有3％的αAI，而在一般菜豆中只含有1％～2％。αAI可以抑制豌豆象岬幼虫的早期发育，这样可以减少大量损失。将小麦24kDa二聚α-淀粉酶抑制因子用于转基因抗虫安全性好，更易于人们接受。但是目前还没有从基因水平研究不同抑制因子间的结构与功能差异，以及对不同来源的淀粉酶起到抑制作用，无法选择更合适的抑制因子基因进行转基因工作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因序列TD5-1、TD5-2和TD5-3。通过本专利技术人对小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因进行的详细研究，首次从野生二粒小麦TD5中克隆得到3个编码基因完整序列。并且开展了基于该基因的分子标记研究。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案本专利技术以普通小麦供体野生二粒小麦为材料，通过根据EST数据库中保守片段设计的引物，利用PCR技术扩增得到目的片段，并将目的片段克隆入pBluescript SK(+)载体中。获得3个小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因序列和氨基酸序列。野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-1)，该序列如下TD5-11ATGCTCGTGG CGACACCCAT AGCGGCCGAG TACGACGCAT GGAGCGTTAA CAGTGGTCCC61 TGGATGTGCT ATCCAGGGTA TGCCTTTAAG GTGCCAGCGC TCCCTGGCTG TCGTCCAGTG121 CTGAAGCTCC AGTGCAATGG CAGCCAGGTG CCCGAGGCTG TCCTAAGGGA CTGCTGCCAG181 CAGCTCGCCG ACATCAGCGA GTGGTGCAGG TGCGGTGCCC TCTACAGCAT GTTGGACAGC241 ATGTATAAGG AGCATGGCGT GCAGGAGGGA CAGGCGGGGA CAGGCGCGTT CCCAAGCTGC301 CGGAGGGAGG TGGTGAAGCT GACGGCGGCG AGCATCACGG CGGTCTGCAA GCTACCCATC361 GTCATTGATG CGTCTGGAGA TGGAGCGTAT GTCTGCAAGG GTGTGGCCGC ATACCCGGAC421 GCCTAG以上序列为野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-1)，运用基因工程的方法可对结构进行改造，得到野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-1)的衍生序列，该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种变构体。根据野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-1)，得到其氨基酸序列，该序列如下1MLVATPIAAE YDAWSVNSGP21 WMCYPGYAFK VPALPGCRPV41 LKLQCNGSQV PEAVLRDCCQ61 QLADISEWCR CGALYSMLDS81 MYKEHGVQEG QAGTGAFPSC101 RREVVKLTAA SITAVCKLPI121 VIDASGDGAY VCKGVAAYPD141 A*野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-2)，该序列如下TD5-21ATGCTCGTGG CGACACCCGT AGCGGCTAAG TACGATGCAT GGAGCGATAA CAGTGGTCCT61 TGGATGTGCT ATCCAGGGTA TGCCTTCCAG GTGCCCGCGC TCCCTGGCTG TCGTCCACTG121 CTGAAGCTCC AGTGCAATGG CAGCCAGGTG CCCGAGGCTG TCGTAAGGGA CTGCTGCCAG181 CAGCTCGCCA ACATCAGCGA GTGGTGCAGG TGCGATGCCC T本文档来自技高网...

【技术保护点】
野生二粒小麦α－淀粉酶抑制因子的编码基因序列，其特征在于，所述基因序列为序列表中ＳＥＱＩＤＮｏ．１或ＳＥＱＩＤＮｏ．３或ＳＥＱＩＤＮｏ．５所示的核酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑有良，王际睿，魏育明，颜泽洪，李伟，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]