一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用技术

本发明专利技术属于全程热启动Taq酶制备技术领域，公开了一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、用途。该配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对温度≤96℃条件热稳定，在温度≤96℃时，其封闭或开放Taq酶活是可逆的，可在整个PCR循环中全程参与Taq酶的热启动，实现每个循环过程都是在引物与模板处于严谨配对时Taq酶热启动，避免非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高了反应特异性和灵敏度，使得DNA聚合酶链式反应结果杂带少、噪音低，保真性更完善，同时又由于上述配体为短肽结构，与抗体相比较，分子量更小，对PCR干扰小，且不像单链DNA那样容易降解，用其制备的全程热启动Taq酶产品稳定性更好。

A thermostable affinity ligand for Taq enzyme temperature control and its preparation and Application

The invention belongs to the whole hot start Taq preparation technology field, discloses a Taq heat stable enzyme affinity ligand and its preparation method and application thereof. The ligands of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 shows, the temperature are less than 96 in the condition of thermal stability, temperature less than 96 DEG C, the closed or open Taq enzyme activity is reversible, hot start can participate in the entire process of Taq enzyme in the whole PCR cycle, each cycle of implementation process is a start Taq enzyme thermal matching in rigorous primer and template, avoid non-specific amplification and primer dimers with two, improve the reaction specificity and sensitivity, the polymerase chain reaction DNA results with less clutter, low noise, fidelity is more perfect, but also because of the short peptide ligand structure, compared with the antibody. The molecular weight of PCR is smaller, less interference, and unlike the single stranded DNA as easy degradation, made of the whole hot standby start Taq enzyme products better stability.

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用
本专利技术属于热启动Taq酶制备
，具体涉及一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用。
技术介绍
热启动Taq酶又称热启动耐高温DNA聚合酶，已越来越多地被用于PCR技术中，特别是多位点基因复合扩增技术中，如在动植物的微卫星基因、人的个体识别或亲子鉴定分析中。这种酶与普通Taq酶相比其最大的特点是：热启动Taq酶的酶活是在反应体系由高温(95℃)降至退火温度的过程中释放恢复的，即在反应体系中引物与模板处于一种严谨性配对结合状态下开始PCR扩增的，所以这种扩增是一种较严谨真实的扩增，杂带少、本底少、噪音低、效率高。目前，制备热启动Taq酶的方法包括以下几种：石蜡包被法、抗体介导抑制法、化学修饰法、ssDNA链(适配子)结合法和肝素盐法。然而，通过这些方法制备的热启动Taq酶都是PCR开始循环阶段的“一次性热启动”，在石蜡包被法的制备过程中酶易被污染，抗体介导抑制法和肝素盐法因抗体和肝素盐分子量很大会影响PCR扩增过程，ssDNA链(适配子)结合法中单链DNA对热不稳定，因此上述方法制备的热启动Taq酶经过一个PCR循环就被降解贻尽，不稳定，无法全程热启动。再如中国专利文献CN101050453B公开的一种热启动耐高温DNA聚合酶及其制备方法，其通过特定的化学修饰法来可逆地封闭DNA聚合酶的活性，同时该酶在弱碱性条件下(pH＝8-9)经高温(94℃以上)处理一定时间，DNA聚合酶的活性经过解封闭逆转而得到恢复。经过该方法修饰的耐高温DNA聚合酶在DNA聚合酶链式反应过程中，极大地降低了DNA聚合酶在低温时的3’到5’端延伸的酶活性，从而极大地提高了该DNA聚合酶的反应特异性、可靠性、均一性和灵敏度，然而上述的热启动耐高温DNA聚合酶第一个循环为热启动酶，而后续循环就是普通Taq酶，也属于“一次性热启动”，因此使用上述的热启动耐高温DNA聚合酶进行DNA聚合酶链式反应还会存在一定的杂带和噪音，保真性不完善。鉴于此，如何对现有的热启动Taq酶的制备方法进行改进以获得一种全程热启动Taq酶，这对于本领域的技术人员来说仍然是一个尚未解决的技术难题。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有的热启动耐高温DNA聚合酶进行DNA聚合酶链式反应存在杂带、噪音及保真性不完善的问题，从而提供一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体，所述配体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术提供了一种制备上述的热稳定的Taq酶温控亲和性配体的方法，包括如下步骤：(1)从噬菌体表面展示肽库中淘选出温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的阳性噬菌体；(2)扩增步骤(1)中的阳性噬菌体，经消化酶消化后进行过滤，获得含有温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的配体的滤液，加热所述滤液至93-99℃保持110-130min，然后将所述滤液与所述Taq酶混合，从中筛选出在温度≤65℃条件下无Taq酶活性且温度>65℃条件下有Taq酶活性的滤液及其对应的阳性噬菌体；(3)取步骤(2)中筛选出的所述阳性噬菌体，扩增后经消化酶消化过滤或分析其表面的展示肽亲和配体的序列组成后进行人工合成，获得所述热稳定的Taq酶温控亲和性配体，即得。优选的是，所述步骤(2)中所述滤液在96℃至少保持120min后仍有活性。优选的是，在所述步骤(2)中或所述步骤(3)中，所述消化酶为胰蛋白酶。本专利技术提供了一种上述热稳定的Taq酶温控亲和性配体或上述方法制备的热稳定的Taq酶温控亲和性配体在制备Taq酶活性的热稳定温控开关中的用途。所述热稳定的Taq酶温控亲和性配体可与Taq酶按比例混合而作为该Taq酶活性的热稳定温控开关，开关转换点温度为65℃，可在整个PCR循环过程中参与Taq酶的热启动。本专利技术提供了一种Taq酶活性的热稳定温控开关，包括上述热稳定的Taq酶温控亲和性配体或上述方法制备的热稳定的Taq温控酶亲和性配体。本专利技术提供了一种全程热启动Taq酶，包括上述的热稳定的Taq酶温控亲和性配体、上述的方法制备的热稳定的Taq酶温控亲和性配体或上述的Taq酶活性的热稳定温控开关和Taq酶。优选的是，将pfu为108-109的噬菌体经消化酶消化过滤后的滤液稀释1000～10000倍后与10μg/μLTaq酶等体积混合。优选的是，通过人工合成的Taq酶温控亲和性配体与Taq酶按摩尔比为5～50：1混合。本专利技术提供了一种试剂盒，包括上述所述的全程热启动Taq酶。本专利技术的技术方案，具有如下优点：1.本专利技术所述的热稳定性的Taq酶温控亲和性配体，所述配体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，该配体与Taq酶的结合或解脱过程如图5所示，该配体在温度≤96℃条件下热稳定，当温度≤65℃时，上述配体可与Taq酶结合并封闭酶活，当温度高于65℃而低于96℃时，与Taq酶结合的上述配体解离下来，Taq酶酶活得到恢复，当温度再次≤65℃时，解离下来的上述配体再次与Taq酶结合并封闭酶活，当温度再次高于65℃而低于96℃时，上述配体再次解离并恢复Taq酶酶活，其封闭或开放Taq酶活是一种温变可逆过程，也可被理解为Taq酶活性区的温控开关，开关转换点为65℃，该配体可在整个PCR循环过程中全程参与Taq酶的热启动，实现每个循环过程都是引物与模板处于严谨配对时酶活的热启动，从而避免了非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高了反应特异性和灵敏度，使得DNA聚合酶链式反应结果杂带更少、噪音更低，保真性更完善，同时又由于所述热稳定性的Taq酶温控亲和性配体为短肽结构，与抗体相比较，分子量更小，对PCR干扰更小，且不像单链DNA那样容易降解，所以使用其制备出来的全程热启动Taq酶产品稳定性更好。2.本专利技术所述的一种制备所述的热稳定的Taq酶温控亲和性配体的方法，包括如下步骤：(1)从噬菌体表面展示肽库中淘选出温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的阳性噬菌体；(2)扩增步骤(1)中的阳性噬菌体，经消化酶消化后进行过滤，获得含有温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的配体的滤液，加热所述滤液至93-99℃保持110-130min，然后将所述滤液与所述Taq酶混合，从中筛选出在温度≤65℃条件下无Taq酶活性且温度>65℃条件下有Taq酶活性的滤液及其对应的阳性噬菌体；(3)取步骤(2)中筛选出的所述阳性噬菌体，扩增后经消化酶消化过滤或分析其表面的展示肽亲和配体的序列组成后进行人工合成，获得所述热稳定的Taq酶温控亲和性配体，即得；在上述方法中，通过噬菌体表面展示肽库中淘选出具有热稳定的Taq酶亲和性且对温度≤96℃下热稳定的表面展示肽及对应的阳性噬菌体，可通过扩增阳性噬菌体并经消化酶消化过滤得到，也可以通过分析阳性噬菌体表面展示肽的序列组成后人工合成，这两种方法均免去了动物免疫、饲养、检测、提取和纯化等一系列繁琐的抗体生产程序，提高了生产的效率并降低了成本。3.本专利技术所述的一种全程热启动Taq酶，包括热稳定的Taq酶温控亲和性配体和Taq酶，其在温度≤65℃时被热稳定的Taq酶温控亲和性配体封闭了活性，当温度高于65℃而本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体，其特征在于，所述配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体，其特征在于，所述配体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种制备权利要求1所述的热稳定的Taq酶温控亲和性配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从噬菌体表面展示肽库中淘选出温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的阳性噬菌体；(2)扩增步骤(1)中的阳性噬菌体，经消化酶消化后进行过滤，获得含有温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的配体的滤液，加热所述滤液至93-99℃保持110-130min，然后将所述滤液与所述Taq酶混合，从中筛选出在温度≤65℃条件下无Taq酶活性且温度>65℃条件下有Taq酶活性的滤液及其对应的阳性噬菌体；(3)取步骤(2)中筛选出的所述阳性噬菌体，扩增后经消化酶消化过滤或分析其表面的展示肽亲和配体的序列组成后进行人工合成，获得所述热稳定的Taq酶温控亲和性配体，即得。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述滤液在96℃至少保持120min后仍有活性。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中或所述步骤(3)中，所述消化酶为胰...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂祖新，郑国华，熊勇华，陈媛，张莉莉，刘卓荣，杜建华，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36