膜蛋白在具有细胞壁的真核细胞中的定向进化制造技术

本发明专利技术涉及用于从文库选择表达的序列的方法，其包括以下步骤：多个包含细胞壁的真核细胞中的每个包含文库的核酸序列成员，其在所述真核细胞中表达为靶膜蛋白。所述细胞的细胞壁是透化的。所述透化的细胞使用能够结合到所述靶膜蛋白的配体标记。所述配体带有可检测的标记。选择所述标记的细胞的子集作为存在的可检测标记的函数。最终，在分离步骤中，从所述选择的细胞分离表达的核酸序列。

Directed evolution of membrane proteins in eukaryotic cells with cell walls

The invention relates to a method for selecting sequences expressed from a library, which comprises the following steps: multiple nucleic acid sequence members containing every cell library containing the cell wall, which are expressed as target membrane proteins in eukaryotic cells. The cell walls of the described cells are permeable. The permeable cells use ligand labeling that can be combined with the target membrane protein. The ligands have detectable markers. Select the subset of the labeled cells as a function of the detectable markup. Finally, in the separation step, the nucleic acid sequences expressed from the selected cells are separated.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】膜蛋白在具有细胞壁的真核细胞中的定向进化说明尽管在表达、纯化和结晶策略方面有进步技术，真核生物跨膜受体的结构和详细的生物化学研究仍然受到阻碍。主要的困难是缺乏产生足够数量的所需受体的能力及其固有的不稳定性。通过定向进化提高大肠杆菌中GPCR的功能性表达水平的方法是本领域中已知的(Sarkar等(2008),PNAS105:14808-14813；Dodevski&Plückthun(2011),JMolBiol408:599-615)。使用该方法已经分离出几种GPCR的高表达变体。然而，由于大肠杆菌不能进行翻译后修饰，缺乏真核生物膜蛋白的分泌质量控制和易位机制，以及在膜组成上不同，因此真核生物的跨膜受体在大肠杆菌中的进化限于在原核系统中固有表达高于成功进化所需的阈值的受体，因此对于真核生物的加工或膜组成没有严格的要求。因此，需要建立快速、有效和稳定的方法以增加跨膜受体在真核宿主中的功能性表达。原则上，理想的真核宿主将是用于生产进化了的高表达变体的细胞。然而，这些哺乳动物或昆虫细胞不容易使用文库转化，这对于任何类型的定向进化方法是必需的。对于涉及文库的其它过程，使用“较低级的”真核生物如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是常见的。然而，酵母细胞包含细胞壁，其通过限制所给予的配体到达位于质膜中的表达受体来限制功能性分析。对于可溶性蛋白质，该问题的常见解决方案是使用诸如酵母展示之类的方法，其将感兴趣的蛋白表达为存在于细胞壁外面的融合蛋白。然而，该方法不适用于选择不溶性跨膜受体的功能性高表达变体，其必须位于质膜中，并因此位于细胞壁之下，并且不能表达为附着于细胞壁的融合蛋白。本专利技术针对的问题是提供新颖有效的方法来促进和加快跨膜受体的研究和药物设计，特别是通过鉴别跨膜蛋白变体，在包含细胞壁的真核细胞中产生优化的功能性表达。这个问题由独立权利要求的主题解决。术语和定义在本说明书的上下文中，术语“碱性pH”以其在化学领域中已知的含义使用；它指对水溶液的碱度的度量。pH大于7表示碱性(alkaline)或碱性(basic)溶液，pH小于7表示酸性溶液。在本说明书的上下文中，术语“还原剂”以其在化学和生物化学领域中已知的含义使用；它指在氧化还原反应中向另一种化学物质提供电子的元素或化合物。在这个过程中，还原剂被氧化。在本说明书的上下文中，术语“荧光细胞分选或荧光激活的细胞分选(FACS)”以其在细胞生物学领域中已知的含义使用；它们指用于细胞分选的方法，其中细胞悬浮于流体中并通过检测装置。根据通过的细胞的特定荧光信号的强度，每个通过的细胞可以被引导进入不同的隔室中。在本说明书的上下文中，术语“随机诱变”以其在细胞生物学和分子生物学领域中已知的含义使用；它指其中将DNA突变随机引入以产生突变基因和蛋白的方法。然后可以将许多这些突变基因编译到文库中。随机诱变方法的非限制性实例为易错PCR、UV辐射和化学诱变剂。在本说明书的上下文中，术语“文库”以其在细胞生物学和分子生物学领域中已知的含义使用；它指核酸片段的集合。一种特定类型的文库是通过随机诱变产生的随机的突变体文库。另一种实例为设计的(或合成的)文库，其包含专门工程化的DNA片段。在本说明书的上下文中，术语“表达水平”以其在细胞生物学和分子生物学领域中已知的含义使用；它分别指DNA片段及其衍生mRNA的转录水平和/或翻译水平。在某些实施方案中，如果突变基因的表达高于对照基因或野生型基因，则表达水平被认定为是高的。在某些实施方案中，突变基因的表达比对照或野生型基因的表达至少高两倍被认定为高的。根据本专利技术的第一方面，提供了一种用于从表达的核酸序列的文库选择序列的方法，其中根据其表达水平选择序列。所述方法包括以下步骤：a)提供多个包含细胞壁的真核细胞，特别是多个酵母细胞，其中所述真核细胞中的每个包含所述文库的核酸序列成员。所述核酸序列成员为在所述细胞中可操作的启动子序列的控制下表达的所述细胞的转基因，其在所述多个包含细胞壁的真核细胞中作为靶膜蛋白。b)在透化步骤中，透化所述多个包含细胞壁的真核细胞的细胞壁，产生多个活的透化的细胞。c)在标记步骤中，将所述多个活的透化的细胞与能够特异结合到所述靶膜蛋白的配体接触。所述配体包括可检测的标记，产生多个活的透化的细胞。d)在洗涤步骤中，洗涤所述多个活的透化的细胞，从而除去没有特异性结合到所述靶膜蛋白的大多数的(如果不是则是基本上所有的)任何配体和可检测的标记。e)在选择步骤中，检测所述多个活的标记的细胞中的每个存在的可检测的标记，并且选择所述多个活的标记的细胞的子集作为存在于所述多个活的标记的细胞的可检测标记的函数。换言之，选择显示任何标记或标记数量高于某阈值的所述细胞，产生选择的活细胞。f)在分离步骤中，从所述选择的细胞分离表达的核酸序列。换言之，根据本专利技术的第一方面的方法实现了跨膜受体的文库在包含细胞壁的真核细胞中的表达，并实现了对这些受体的功能性表达的选择。通过以仍然维持活的和结构稳定的细胞的方式对细胞壁透化使这成为可能，其不同于细胞壁透化的其他方法，例如制备原生质球。本专利技术的透化过程甚至实现了大配体与跨膜受体的结合。通过结合配体的数量选择细胞能够根据质膜上功能性受体的数量而不是通过总的受体数量来选择细胞，总的受体数量还包括非功能性受体(例如存在于细胞内膜中的受体)。在某些实施方案中，所述方法另外包括以下步骤：i.在选择步骤e)后，在扩增步骤中，扩增选择的活细胞，产生扩增的选择的活细胞。所述扩增的选择的活细胞按该顺序经受步骤b)至e)，和ii.将步骤i.进行至少1、2、3、4、5、6或7次，最后跟随分离步骤f)。在某些实施方案中，所述选择步骤包括众多的选择过程。在第一次选择后，再次使用选择的细胞用以选择这些细胞的子集作为存在于这些细胞中的可检测标记的函数。选择细胞重复至少1、2、3、4或5次。在某些实施方案中，通过扩增编码靶膜蛋白的核酸序列，通过将突变引入到扩增序列的方法，获得表达的核酸序列的文库。在某些实施方案中，所述方法另外包括以下步骤：i.将在分离步骤f)中获得的表达的核酸引入到多个包含细胞壁的真核细胞中，并在其中表达，ii.根据本专利技术的第一方面，使多个包含细胞壁的真核细胞以该顺序经受步骤b)至f)，和iii.将步骤i.和ii.进行至少1、2、3、4、5、6或7次。在某些实施方案中，通过本专利技术的方法获得的表达的核酸序列的特征在于编码的靶膜蛋白的高表达水平和/或高热力学稳定性。在某些实施方案中，根据本专利技术的所有方面，在选择步骤e)中，选择的活细胞包括最强荧光细胞的前0.1％至5％。在某些实施方案中，所述方法另外包括以下步骤：i.通过将突变引入到扩增序列中的方法，扩增在分离步骤f)中获得的表达的核酸，产生核酸序列的第二文库。ii.将该核酸序列的第二文库转移到多个包含细胞壁的真核细胞。iii.根据本专利技术的第一方面的方法，将多个包含细胞壁的真核细胞(现在包含第二文库的核酸序列成员)按该顺序递送至步骤b)至f)。在某些实施方案中，包含细胞壁的真核细胞为酵母细胞。在某些实施方案中，靶膜蛋白为G-蛋白偶联受体(GPCR)。在某些实施方案中，透化步骤包括将多个包含细胞壁的真核细胞暴露于酶处理和/或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从表达的核酸序列的文库选择序列的方法，其包括以下步骤：a)提供多个包含细胞壁的真核细胞，其中所述真核细胞中的每个包含所述文库的核酸序列成员，并且所述核酸序列成员被表达为在所述多个真核细胞中的靶膜蛋白，b)在透化步骤中，透化所述多个真核细胞的所述细胞壁，产生多个透化的细胞，c)在标记步骤中，使所述多个透化的细胞与能够结合到所述靶膜蛋白的配体接触，其中所述配体包括可检测标记，产生多个标记的细胞，d)在洗涤步骤中，洗涤所述多个标记的细胞，e)在选择步骤中，选择所述多个标记的细胞的子集作为存在于所述多个标记的细胞中的可检测标记的函数，产生选择的细胞，和f)在分离步骤中，从所述选择的细胞分离表达的核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.22 EP 14199729.61.一种用于从表达的核酸序列的文库选择序列的方法，其包括以下步骤：a)提供多个包含细胞壁的真核细胞，其中所述真核细胞中的每个包含所述文库的核酸序列成员，并且所述核酸序列成员被表达为在所述多个真核细胞中的靶膜蛋白，b)在透化步骤中，透化所述多个真核细胞的所述细胞壁，产生多个透化的细胞，c)在标记步骤中，使所述多个透化的细胞与能够结合到所述靶膜蛋白的配体接触，其中所述配体包括可检测标记，产生多个标记的细胞，d)在洗涤步骤中，洗涤所述多个标记的细胞，e)在选择步骤中，选择所述多个标记的细胞的子集作为存在于所述多个标记的细胞中的可检测标记的函数，产生选择的细胞，和f)在分离步骤中，从所述选择的细胞分离表达的核酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中：i.在所述选择步骤e)后，在扩增步骤中扩增所述选择的活细胞，产生扩增的选择的活细胞，并且所述扩增的选择的活细胞经受所述步骤b)至e)，ii.所述步骤i.进行至少1、2、3、4、5、6或7次，最终跟随所述分离步骤f)。3.根据权利要求1所述的方法，其中：i.将在所述分离步骤f)中获得的表达的核酸引入多个包含细胞壁的真核细胞并在其中表达，ii.所述多个包含细胞壁的真核细胞经受根据权利要求1的所述步骤b)至f)，和iii.步骤i.和ii.进行至少1、2、3、4、5、6或7次。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过将突变引入所述扩增序列的方法扩增在所述分离步骤f)中获得的所述表达的核酸，产生核酸序列的第二文库，和i.将所述核酸序列的第二文库转移至所述多个包含细胞壁的真核细胞，和ii.将所述多个包含细胞壁的真核细胞递送至根...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·许茨，A·普鲁克图恩，
申请(专利权)人：苏黎士大学，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH