一种百合总RNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种百合总RNA提取方法，是在传统Trizol法的基础上，使用氯仿对样品提纯去杂3次，并使用75%乙醇对RNA沉淀洗涤2次。本发明专利技术方法不仅能更好地去除RNA样品中的杂质，而且提取的RNA浓度高，可用于提取百合各个品种、各个器官的高质量RNA。

【技术实现步骤摘要】
一种百合总RNA提取方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种RNA的提取方法，特别是涉及一种优化的植物百合总RNA提取方法。
技术介绍
从植物中提取总RNA，是开展植物研究工作的重要前提。高质量的RNA是后续RT-PCR以及基因克隆、表达的基础。目前比较成熟的总RNA提取方法有Trizol法、CTAB法和试剂盒法。Trizol法和试剂盒法提取RNA试验操作简单，是各种物种提取RNA的首选方法。但对于富含多糖和多酚的物种材料，以Trizol法提取RNA存在污染，而试剂盒法提取的RNA则浓度过低。同样，采用CTAB法也存在操作复杂耗时、容易污染的不足，不能用于后续基因表达分析及基因克隆等。百合各组织中富含多糖和多酚物质。由于多糖的许多理化性质与RNA很相似，从而在沉淀RNA时，往往会产生富含多糖的凝胶状沉淀。这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水或溶解后产生黏稠状的溶液；而如果采用重复操作去杂的话，在去除多糖的同时，RNA也容易被带走，造成RNA得率的减少。因此，百合中存在的大量多糖影响了提取RNA的质量和浓度。事实上，富含多糖和多酚物质组织的RNA提取都存在此种问题，或者提取方法费时费工，RNA容易污染，或者获得的RNA量太少，不能满足后续研究的需求。因此，需要开发一种针对含有多糖多酚材料的总RNA提取方法，以满足从包括百合在内的、富含多糖多酚器官中提取高质量RNA的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种百合总RNA提取方法，该方法适合于包括百合在内的、富含多糖多酚器官的总RNA提取。本专利技术所述的百合总RNA提取方法包括：1）取百合样品置于液氮中，研磨成细粉，以每ml裂解液加0.1g样品的比例加入裂解液中，震荡3min，离心，取上清静置，使核酸蛋白复合物完全分离；2）在上清中加入所述上清体积20%的氯仿，室温静置3min后，剧烈震荡离心，取上清液，再加入氯仿，重复3次；3）取上清，加入上清体积50%的异丙醇，室温静置10min后，颠倒混匀后离心，弃除上清，保留底部沉淀；4）在沉淀中加入等体积的75%乙醇，颠倒混匀，充分洗涤，离心，再加入75%乙醇洗涤1次，自然干燥；5）将干燥的沉淀以不少于30μL的DEPC-ddH2O溶解，得到RNA提取液。其中，所述的百合样品是将百合样品离体后置于冰上，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存的样品。本专利技术上述提取方法中，所述裂解液可以是GenStar的TRIGene、TaKaRa的RNAisoPlus等各种常规Trizol法所使用的裂解液。在Trizol提取法的操作说明书中，使用氯仿提纯样品的操作以及对RNA沉淀的洗涤过程均只进行一次，没有重复。因此，完成整个RNA提取过程仅需要3h。但是，完全按照Trizol说明书方法提取百合的RNA后发现，该方法所获得的RNA不仅纯度不够，而且污染严重。而试剂盒法提取RNA的过程将样品的裂解与提纯去杂步骤合并在了一起，由此导致一次处理样品的数量减少，虽然用时较短，只有约2h，但每1.5mL管只能获得20ng左右的RNA，这样的量不足以满足后续研究的需要。本专利技术通过改良的Trizol法提取百合总RNA，该提取方法中，第2步利用氯仿对样品提纯去杂3次，第4步对RNA沉淀洗涤2次，不仅更好地去除了RNA样品中的杂质，而且每1.5mL管可以获得100ng左右的RNA。本专利技术提取方法操作简单、效率高、使用试剂简单，提取RNA质量高、浓度高，可用于提取百合各个品种、各个器官的高质量RNA。附图说明图1是实施例1提取百合总RNA的电泳图。图2是实施例2提取百合总RNA的电泳图。图3是比较例1提取百合总RNA的电泳图。图4是比较例2提取百合总RNA的电泳图。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术进行进一步的详细说明。下述各实施例提取过程中，所使用的各种器具，包括离心管、枪头、研钵、研棒、钥匙等，均要先在121℃灭菌20min。提取过程中需要的75%乙醇，使用DEPC-ddH2O配置。各实施例需要的百合样品是将采集的样品离体后置于冰上，液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存的样品。实施例1本实施例使用GenStar的TRIGene总RNA提取试剂盒提取百合中的RNA。具体操作流程为：1、在1.5mL离心管中加入1mLGenStar的TRIGene总RNA提取试剂，置于冰上。2、在液氮中研磨百合样品，研磨过程中样品要一直处于冰冻状态，不可解冻。取0.1g左右研好的样品加入上述离心管中，在涡旋振荡器上震荡3min。3、4℃下12000×g离心10min，吸取上清至新的离心管中。4、裂解产物于室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。5、加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。6、4℃下12000×g离心15min，样品分为三层：红色下层，中间薄膜层，以及颜色随样品而变的上层。7、吸取上层至一新的离心管中，大约0.5mL。8、再重复步骤5～7两次，其中每次吸取出的上层体积分别为0.4mL和0.3mL。9、加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。10、4℃下12000×g离心10min，弃除上清，得到胶状RNA沉淀。11、加入1mL75%乙醇，颠倒混匀，洗涤沉淀。12、4℃下7500×g离心5min，弃除上清。13、重复步骤11～12一次。14、用移液枪吸取离心管内残余液体，室温晾干10～20min。15、加入30μLDEPC-ddH2O，移液枪吹打数次溶解RNA。16、通过RNA电泳及核酸仪检测。17、分装后-80℃保存，避免反复冻融。以上操作流程共耗时4.5h。图1给出了本实施例提取的百合总RNA的电泳图，从图中可以看出，RNA既无降解(无拖尾现象)，也无污染(点样孔无残留)。进而，以核酸仪检测本实施例得到RNA的浓度为93.1ng/µL。说明本实施例方法适用于百合总RNA的提取。实施例2本实施例使用TaKaRa的RNAisoPlus裂解液替代实施例1中的TRIGene裂解液，具体操作流程与实施例1完全相同，步骤8中每次吸取出的上层体积分别为0.35mL和0.25mL。操作流程共耗时4.5h。提取效果如图2所示，核酸仪检测RNA浓度为143.6ng/µL。本实施例提取的RNA同样既无降解(无拖尾现象)也无污染(点样孔无残留)，适用于百合总RNA的提取。比较例1（试剂盒法）本实施例使用天根植物总RNA提取试剂盒(RNAprepPure)提取百合总RNA，具体提取过程按照以下步骤进行。1、取50～100mg百合植物叶片，在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μlRL(加入β-巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀。2、将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，以12000rpm离心2～5min，小心吸取收集管中上清至RNase-Free的离心管中。3、缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液与沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中。4、向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中。5、向吸附柱CR3中央加入80μlDNaseI工作液，室温放置15min。6、向吸附柱CR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种百合总RNA提取方法，包括：1）取百合样品置于液氮中，研磨成细粉，以每ml裂解液加0.1g样品的比例加入裂解液中，震荡3min，离心，取上清静置，使核酸蛋白复合物完全分离；2）在上清中加入所述上清体积20%的氯仿，室温静置3min后，剧烈震荡离心，取上清液，再加入氯仿，重复3次；3）取上清，加入上清体积50%的异丙醇，室温静置10min后，颠倒混匀后离心，弃除上清，保留底部沉淀；4）在沉淀中加入等体积的75%乙醇，颠倒混匀，充分洗涤，离心，再加入75%乙醇洗涤1次，自然干燥；5）将干燥的沉淀以不少于30μL的DEPC‑ddH2O溶解，得到RNA提取液。

【技术特征摘要】
1.一种百合总RNA提取方法，包括：1）取百合样品置于液氮中，研磨成细粉，以每ml裂解液加0.1g样品的比例加入裂解液中，震荡3min，离心，取上清静置，使核酸蛋白复合物完全分离；2）在上清中加入所述上清体积20%的氯仿，室温静置3min后，剧烈震荡离心，取上清液，再加入氯仿，重复3次；3）取上清，加入上清体积50%的异丙醇，室温静置10min后，颠倒混匀后离心，弃除上清，保留底部沉淀；4）在沉淀中...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊俊苗，杜方，王婷，张浩宇，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西,14