本发明专利技术公开了一个针对弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤相关抗原的特异性Ｔ细胞受体的核苷酸序列。通过ＲＴ－ＰＣＲ基因扫描分析ＤＬＢＬ患者外周血中ＴＣＲＶα６亚家族呈明显单克隆，其ＰＣＲ产物进行序列分析了特异性ＴＣＲ序列的Ｖ－Ｎ－Ｊ区，即互补决定区３，是和抗原特异性识别结合的部位；表明该克隆性Ｔ细胞的ＴＣＲ为ＤＬＢＬ相关抗原刺激所产生的特异性ＴＣＲ。它是通过ＴＣＲ转基因技术进行ＤＬＢＬ分子靶向的过继性免疫治疗的基础和关键。该特异性ＴＣＲ的核苷酸序列为进一步开展针对淋巴瘤的特异性细胞免疫治疗提供重要作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一个T细胞受体(TCR)的核苷酸序列，特别涉及弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序列及应用。
技术介绍
近年来，非霍奇金淋巴瘤(NHL)发病率呈持续上升趋势。据估计，21 世纪初，NHL将占侵袭性恶性肿瘤的4.4M，并占所有癌症死亡数的4.8%。其 中弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBL)是最常见的NHL，约占30% 40%，其中 超过60岁的老年患者占70%。 20多年来主要采用以CHOP方案(环磷酰胺、 多柔比星、长春新碱、泼尼松)为主的化疗。但对部分老人有毒性作用，长期 生存率低。近期开展的靶向免疫治疗如利妥昔单抗(CD20单抗)的出现虽然 取得了新的疗效,但微小残留病变的存在导致的疾病复发仍然是目前临床治疗 的棘手问题。多年来，各国学者一直在努力寻求更有效的治疗方法。临床肿瘤 学家对特异性的细胞免疫治疗寄予厚望。Xue等于报道利用从白血病患分离出 能够特异识别HLA-A2限制的WT1抗原表位的CTL，将CTL的TCR基因转 染患者的T淋巴细胞，在小鼠试验中显示出转染细胞的特异杀伤性。随后Tsuji 等将从进一步证明了利用转导WT1特异的TCR基因的Thl和Tcl显示出HLA 限制的的杀伤作用，同时转染的Thl细胞具有分泌大量IFN-Y和IL-2的功能， 由于IFN-y和IL-2在遏制肿瘤中发挥重要的作用，因而可以通过该转染相应 的TCR基因的方法对肿瘤的免疫治疗发挥重要的作用。目前利用肿瘤细胞相关抗原特异的TCR基因修饰正常T细胞(自体的或 供者源T细胞)，从而获得具有杀伤相应肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞(CTL), 这是近年抗肿瘤特异性细胞免疫治疗的一个重要发现。抗原特异TCR修饰正 常T细胞而获得特异抗肿瘤T细胞克隆的研究首先在黑色素瘤中展开，随后 有多个研究扩展了该技术的应用，如特异性抗EB病毒阳性细胞的CTL、抗 WT1的CTL，个别已形成了 TCL产品用于临床治疗。制备CTL产品的关键 是明确肿瘤/白血病细胞的相关抗原，从而获得抗原特异的TCR，进而诱导产生特异抗白血病/肿瘤的T细胞克隆。目前国内外对淋巴瘤的研究主要集中在 T细胞型淋巴瘤，而对B淋巴细胞淋巴瘤的研究资料较少，主要原因可能是对 B淋巴细胞型淋巴瘤的相关抗原了解得较少有关。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的不足，本专利技术的首要目的在于提供一种弥漫 性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Vct6亚家族的MS基因序列。本专利技术从DLBL患者外周血中存在T细胞受体(TCR) Va亚家族的克隆 性T细胞(TCRa和TCR|3链分别为TCRa|3+T细胞表面所表达的异源双链TCR 的组成部分，两者在T细胞免疫中具有同样重要的地位)，经序列分析显示其 特异性TCR序列的高度可变区V-N-J区，即互补决定区3 (CDR3)，与抗原 特异性识别结合的部位，表明该克隆性T细胞所表达的TCR为DLBL相关抗 原刺激所产生的特异性TCR，获得了 DLBL相关的TCR基因序列。本专利技术公开了针对DLBL相关抗原的特异性TCR的基因序列，尤其是 TCR的高度可变区即CDR3，后者是T细胞表面受体识别抗原的特异区域， 针对于不同抗原，除了机体所选用的TCRVa亚家族T细胞不同，更为关键的 是其TCR基因的CDR3序列的差异，该部位决定了所属T细胞所能识别的抗 原。本专利技术提供的识别DLBL相关抗原的TCR Va6基因序列，由于其CDR3 的特异性，仅来自于单一克隆的T细胞，是一高度特异的序列。同时，根据 CDR3的基因序列编码的蛋白质，可用来了解DLBL的相关抗原肽，为了解 DLBL的生物学特性提供资料。本专利技术的另一目的在于提供上述基因序列的应用。根据所获得的DLBL相关抗原的特异性TCR的核苷酸序列，可以用于(1) 了解DLBL病人所存在的抗DLBL的TCR Va6亚家族T细胞的情况，用于评 价病人的免疫功能状态，(2)通过转基因技术将DLBL相关抗原的特异性TCR 基因转入正常T淋巴细胞中，使其强制表达这种特异性的TCR，改变T细胞 内源性TCR识别抗原的原有模式，具备分泌细胞因子和(或)特异杀伤耙细 胞的功能，经体外短期培养扩增即可产生足量的CTL，再回输入患者体内使 其对DLBL细胞行使靶向细胞免疫效应。本专利技术的目的通过下述技术方案来实现 一种弥漫性大B细胞淋巴瘤相 关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序列，所述MS基因序列如下所示TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCTTCACAACTGGGGGACTCAGCAATGTATTTCTGTGCAATGAGTCCCATGAACACAGGCTTTCAGAAACTTGTATTTGGAACTGGCACCCGACTTCTGGTCAGTCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCT GGAGCAAC。其中，所述基因序列为330个bp: l-65bp为V区；66-70bp为N区；71-130bp 为J区；131-330bp为C区。上述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序 列翻译的蛋白质(110AA)如下VYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFK SNSAVAWSN。其中CDR3区包括V区的下游端、N区和J区的上游端。上述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序 列的制备方法，包括如下步骤a. 收集DLBL患者外周血，Ficoll分层法分离外周血单个核细胞；b. 提取外周血单个核细胞的RNA, RT-PCR合成cDNA第一链；c. 在NCBI的Genebank中査找TCRa链的基因序列，并标出各亚家族的V区 及C区在基因组中的位置；d. 设计29个Va特异性上游引物及Ca下游引物；e. PCR扩增29个Va亚家族TCR重排时产生的V-N-JC区；f. Ca-Fam标记PCR产物，基因扫描分析T细胞亚家族的表达和克隆性；g. 将呈单克隆或寡克隆扫描图的亚家族PCR产物进行切胶纯化序列分析。 上述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序列在制备弥漫性大B细胞淋巴瘤特异性分子靶向过继性免疫药物中的应用。 本专利技术与现有技术相比，具有如下优点和有益效果 (1 )本专利技术制备得到了 一种独特的DLBL抗原的相关TCR Va6基因序列， 该序列可以作为一种新的抗原识别TCR基因(主要变化区在于CDR3序列) 补充人类基因库资料。(2)该TCR基因可用于研究DLBL的特异性免疫诊断和治疗。 上述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Va6亚家族的基因序列，一方面可用于进一步检测病人体内所存在的TCR Va6亚家族T细胞的情况，以评价其细胞免疫功能状态，另一方面是应用在制备弥漫性大B细胞淋巴本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤相关抗原特异ＴＣＲＶα６亚家族的ＭＳ基因序列，其特征在于：所述ＭＳ基因序列如下：ＴＣＣＧＣＣＡＡＣＣＴＴＧＴＣＡＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＧＡＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧ ＣＡＡＴＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＣＴＴＣＴＧＧＴＣＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡ ＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣ ＡＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谭获，李扬秋，尹青松，陈少华，杨力建，叶静梅，
申请(专利权)人：广州医学院第一附属医院，暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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