一种基于原子力显微镜体外分析启动子与RNA聚合酶间交互作用的方法技术

本发明专利技术公开了一种在体外基于原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)分析启动子与RNA聚合酶间交互作用的方法。首先将抛光的单晶硅片进行羟基化处理，硅烷化处理，再经戊二醛将RNA聚合酶固定。在AFM金镀层探针上以自组装单分子层(Self‑assembled monolayers，SAMs)的形式获得启动子修饰的AFM探针；通过AFM力谱技术，控制AFM探针与基底表面靠近，停留并且最终分开，从而记录能够反映启动子与RNA聚合酶会特异性结合的力‑距离曲线，进而获得RNA聚合酶与启动子的结合‑解离过程中的生物物理学参数。

An in vitro method based on atomic force microscopy to analyze the interaction between promoter and RNA polymerase in vitro

The invention discloses a method for in vitro based on atomic force microscope (atomic force microscope, AFM) analysis method and RNA polymerase promoter interaction. First, the polished monocrystalline silicon wafers were hydroxylated, silanated and then immobilized with RNA polymerase through glutaraldehyde. In the AFM gold plating to probe self-assembled monolayers (Self assembled monolayers, SAMs) is obtained in the form of AFM probe modified by AFM promoter; power spectrum technology, control of the AFM probe and the surface of the substrate near the residence, and eventually separated, which records can reflect the promoter and RNA polymerase force distance curve specific binding, binding and dissociation process of biophysical parameters RNA polymerase and the promoter of.

【技术实现步骤摘要】
一种基于原子力显微镜体外分析启动子与RNA聚合酶间交互作用的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于原子力显微镜得到启动子与RNA聚合酶力-距离曲线的方法。
技术介绍
近年来，随着代谢工程及合成生物学的发展，以启动子为代表的代谢调控元件的标准化、模块化处理已成为趋势，因此高效、精确、定量表征启动子活性的方法是一个重要的先决条件。目前启动子强度主要通过报告基因编码的蛋白表达量来表征，如氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicolacetyltransferase，CAT)，β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。然而这种分析方法操作繁琐、周期长、易受到菌体生长阶段和生理状态的干扰，最终的表达量还受到其他多重元件的调控，并不能直接体现启动子的调控效果，并且造成不同表达系统之间的启动子强度数据无法直接比较。加之受到检测方法的限制，导致定量分析效率低，半定量表征，制约了启动子元件化，标准化的发展。AFM技术作为一个原位、不需标记的微观表面成像技术已被广泛熟知。此外，AFM另一个强大的功能为分子操作，而基于AFM的力谱(Forcespectroscopy)分析技术可以实现精确、实时的记录发生在毫秒的一对分子的结合和解离过程，提供两者之间的结合力以及单分子作用力的群体分布。由于力谱分析技术可以提供精确的定量结合力数据；能在体外、液体环境中，接近生理条件下操作；不受细胞生长及生理状态的影响；不涉及其他细胞分子的干扰，是一种研究生物分子交互作用的强有力的手段。现有技术中没有通过采用原子力显微镜直接测量启动子与RNA聚合酶之间的交互作用的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种原子力显微镜用于检测启动子与RNA聚合酶单分子间交互作用的方法，通过对硅基底的一系列化学修饰分别固定RNA聚合酶和启动子在硅基质表面和AFM探针表面，并采用原子力显微镜控制启动子与RNA聚合酶的接触、结合和解离，从而检测启动子与RNA聚合酶单分子间的相互作用，进而提供一种体外研究转录系统的新方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种原子力显微镜用于检测启动子与RNA聚合酶单分子间交互作用的方法。首先将抛光的单晶硅片进行羟基化处理，然后以不同的硅烷化方式处理硅基底，再经戊二醛和RNA聚合酶修饰；合成含有巯基和柔性连接的启动子单链，通过退火形成双链启动子，在AFM金镀层探针上以自组装单分子层的形式获得启动子修饰的AFM探针末端；采用原子力显微镜控制启动子与RNA聚合酶的接触、结合和解离，记录这一过程的力-距离曲线，从而分析启动子与RNA聚合酶反应的过程。包括以下步骤：(1)基底硅表面羟基化：选择抛光的单晶硅片(1×1cm2)作为基底，在食人鱼溶液中洗涤硅片表面30分钟。将羟基化的硅片用超纯水和乙醇漂洗3次。(2)硅烷化方式处理硅基底：在室温下将羟基化的硅片浸于3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐溶液中3h。用超纯水和乙醇漂洗3次。(3)所述基底羟基化硅表面上RNA聚合酶的固定：充分清洗后的羟基化硅表面在室温下浸于戊二醛溶液中活化30min，反应结束后用超纯水漂洗3次。将活化的基底表面浸润在1-1000U/mlRNA聚合酶磷酸盐溶液中，最适的浓度为100U/ml，4℃放置40min，最后用PBS缓冲溶液冲洗3次，去除没有固定的蛋白质。(4)巯基修饰的启动子：实验所用的启动子序列均由杰瑞生物公司合成，体外相互作用所用的启动子序列3'端添加TTTTT柔性连接序列，然后再链接SHC6巯基末端。(5)AFM金镀层探针修饰启动子：将10μmol/L的两条互补DNA链等摩尔比混合于PBS缓冲液中，95℃保温5min，自然缓慢冷却(>8h)至室温。有金镀层的AFM探针用乙醇、超纯水交替浸泡洗涤各10min以清洁金尖端的表面。然后将探针转移到含有3'-巯基修饰的双链启动子(5μmol/L)中12h，以自组装单分子层的形式获得启动子修饰的AFM探针末端。(6)原子力显微镜成像及相互作用力测定：RNA聚合酶基底表面的图像的扫描在智能模式下进行。对实验中用到的每一个针尖进行了弹性系数的校正，测定的探针的弹性常数在0.34-0.6N/m之间。控制力曲线测定时的AFM探针approaching/retracting速度在514-900nm/s之间，使不同探针在测定力曲线时的loadingrate保持一致，为304nN/s。从而检测出启动子与RNA聚合酶间的交互作用力。(7)步骤(1)中，所述的食人鱼溶液为：浓硫酸和双氧水的混合溶液中(浓硫酸(质量分数98％：双氧水(质量分数30％)＝7:3(体积比))。(8)步骤(2)中，3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐溶液为：APTES和磷酸盐混合溶液中(APTES(质量分数96％)：磷酸盐缓冲溶液(20mmol/LNa2HPO4,150mmol/LNaCl,pH7.0)＝1：15(体积比))。(9)步骤(3)中，戊二醛磷酸盐溶液为：戊二醛和磷酸盐混合溶液中(戊二醛(质量分数99％：磷酸盐缓冲溶液(20mmol/LNa2HPO4,150mmol/LNaCl,pH7.0)＝1：1000(体积比))。(10)步骤(6)中，原子力显微镜成像的过程为：AFM成像采用布鲁克的DimensionIcon扫描探针显微镜，将AFM探针放入探针架后，在金属探针上面滴两滴PBS缓冲液，缓慢降低探针，与基底上的PBS缓冲液液滴接触，确保基底与探针之间无气泡后。调节光斑，选择智能模式，扫描固定在基底上的RNA聚合酶形貌。(11)步骤(6)中，利用原子力显微镜测定启动子与RNA聚合酶相互作用力的过程为：在智能模式下得到对样品进行扫描，在得到蛋白在表面的位置信息后，对各个蛋白分子进行10个力曲线的采集。设定探针对基底表面施加400pN的力并停留在基底单分子蛋白表面3s，以保证启动子和蛋白质有足够时间特异性结合。按照此方法，每次实验采集1000条力曲线。本专利技术的有益效果是：本专利技术建立了一种原子力显微镜在体外研究启动子与RNA聚合酶单分子间交互作用的方法。其中启动子和RNA聚合酶的固定方法简单高效，通过原子力显微镜分析启动子与RNA聚合酶的交互作用具有快速、准确、定量的优点。通过本专利技术建立的方法分析转录反应不依赖于细胞培养，不受细胞生理状态的影响，不受其他基因表达调控元件的干扰。可以直观的得到交互作用力信息，是表征转录系统的有效的新方法。附图说明以下结合附图说明本专利技术的特征和有益效果。图1是在PBS缓冲液中用原子力显微镜扫描固定蛋白的硅片(2*2μm2)表面图。图2是参数优化后得到的T7启动子与RNAp的交互作用力-距离曲线。具体实施方式：下面结合实施例对本专利技术进一步说明。实施例1专利技术中AFM探针为金涂覆悬臂探针，原子力显微镜来源于布鲁克DimensionIcon扫描探针显微镜。测体外相互作用所用的启动子序列如下：T7-F：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTTTTT-SHC6T7-R：AAAAAATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT7-10C-F：TAATACGCCTCACTATAGGGAGATTTTTT-SHC6T7-10C-R：AAAAAACTCCCTATAGTGAGGCGTATTAT7-10T-F：AAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于原子力显微镜分析的将RNA聚合酶固定于硅基质表面的方法，其特征是：首先将抛光的单晶硅片进行羟基化处理，硅烷化，再经戊二醛交联，通过RNA聚合酶上的氨基与醛基的缩合反应，将RNA聚合酶固定在硅基质表面。

【技术特征摘要】
1.一种用于原子力显微镜分析的将RNA聚合酶固定于硅基质表面的方法，其特征是：首先将抛光的单晶硅片进行羟基化处理，硅烷化，再经戊二醛交联，通过RNA聚合酶上的氨基与醛基的缩合反应，将RNA聚合酶固定在硅基质表面。2.一种用于原子力显微镜分析的将启动子固定于AFM探针表面的方法，其特征是：合成具有巯基末端、重复碱基的柔性末端的单链启动子序列，通过解链-退火形成双链，在AFM金镀层探针上以HS-Au共价反应的形式获得固定有启动子的AFM探针。3.一种基于原子力显微镜力谱技术的启动子与RNA聚合酶交互作用分析的方法，其特征是：采用原子力显微镜控制修饰有启动子的AFM探针，与固定有RNA聚合酶的基底表面接近/远离，记录这一过程中探针与基底表面的力-距离信息，绘制力-距离曲线，得到两者之间的交互作用信息。4.如权利要求1所述的方法，其特征为，所述单晶硅片硅羟基化处理的具体方法是，选择抛光的适当大小的单晶硅片作为基底，在食人鱼溶液中洗涤硅片表面30min，将羟基化的硅片用超纯水和乙醇漂洗3次。5.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述单晶硅片硅烷化方式处理的具体方法是：在室温下将羟基化处理后的单晶硅片浸于3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐溶液中3h，用超纯水和乙醇漂洗3次。6.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述戊二醛交联、RNA聚合酶上的氨基与醛基的缩合反应的具体方法是，权利要求5处理后的单晶硅片在室温下浸于戊二醛溶液中活化30min，反应结束后迅速用超纯水漂洗3次，将活化的基底表面浸润在500-10000U/mlRNA聚合酶磷酸盐溶液中，在4℃或室温放置30分钟-2小时，最后用PBS缓冲溶液冲洗3次，去除没有固定的蛋白质。7.如权利要求2所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓娟，许正宏，张晓梅，史劲松，姚智绚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32