本发明专利技术涉及一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法，包括：（１）活化的尼龙膜经羟乙基纤维素键合改性；（２）改性后的尼龙膜与环氧氯丙烷、氢氧化钠和硼氢化钠的混合溶液反应，再将膜分别浸入碳酸钠、硼氢化钠和偶联剂的混合溶液和硫酸锌溶液，得到螯合锌离子的金属亲和膜；（３）将上述金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液和洗脱液，接着送入菠萝蛋白酶溶液，然后以洗脱剂进行洗脱，得到菠萝蛋白酶；（４）测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。本发明专利技术方法快速、高效、简便、分离量大，提取的酶活性好，适用于工业规模化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白酶的提纯领域，特别是涉及一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶 的方法。
技术介绍
菠萝蛋白酶(Bromelain)简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或风梨酵素，酶学编号 EC3.4.22.32，是从菠萝果茎、柄、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓縮、酶固定 化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。它是一类巯基蛋白酶，其活性中心 为疏基(一SH)，能进行蛋白质水解等各种生化反应，它可广泛应用于食品、医药 及生物等行业，作为食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解 蛋白等的生产。菠萝蛋白酶的传统提取工艺为吸附法和沉淀法，但是这两种方法工艺繁琐，纯度不 能达到制药工业的需求。《高活性菠萝蛋白酶提取的研究》 一文是采用纳米氧化锌吸 附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥技术工艺，从菠萝茎、皮中提取菠萝蛋白酶，可以有效保 持蛋白酶的活性，还有报道是利用酒精作为沉淀剂来提纯菠萝蛋白酶，这些方法都存 在产物纯度低，酶活低等缺陷。专利CN1980165公开了一种菠萝蛋白酶的物理提取方 法，包括将原料进行清洗、粉碎预处理，再搾汁、离心、冷冻，然后经过滤、超滤、 反渗透和真空干燥处理；专利CN1186118提供了一种菠萝蛋白酶的提取方法，是将 菠萝植株进行冷冻预处理，然后破碎搾汁、超滤、反渗透、再冷冻干燥，物理提取 方法所得菠萝蛋白酶的纯度和酶活性高，然而成本较高，工艺耗能大。膜是具有选择性分离功能的材料，利用它能够实现料液不同组分的分离、纯化和浓缩， 其特点是表面积大、扩散路径短、操作压低、处理量大，膜可以在分子范围内进行分离， 但传统膜分离技术只有分离相对分子质量相差10倍以上的物系，不能满足生化分离的需 要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供， 该方法快速、高效、简便、分离量大，适于工业规模化。本专利技术的，包括 (1)尼龙膜的改性活化后的尼龙膜浸入100 ml 1 wt%~3 wt。/。的羟乙基纤维素溶液 中，室温反应1~3 h,然后转入烘箱，60-90'C烘干1~3 h，用1 wt%~3 wt。/。曲通拉(X—IOO)(聚乙二醇辛基苯基醚)的氢氧化钠NaOH溶液洗去未反应的羟乙基纤维素，再在去离子水 中清洗1~3天；(2) 尼龙膜螯合金属锌离子将上述尼龙膜浸入4 5ml环氧氯丙烷、40 55ml氢氧化 钠和3~6mmol硼氢化钠的混合溶液中，室温反应1~3 h后，加入20~30ml环氧氯丙垸溶液 和40~50ml氢氧化钠溶液，继续恒温振荡反应8~18 h，洗涤后再将膜浸入U0 120ml碳酸 钠、6 9mmol硼氢化钠和80 90mmol偶联剂亚氨基二乙酸(IDA)的混合溶液，50~70。C 反应10 15h，最后浸入500ml 50 150ppm的硫酸锌溶液，反应1 3 h，得到螯合锌离子 的金属亲和膜；(3) 蛋白酶的吸附洗脱将金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入缓冲液 和洗脱液，以0.05mol/LpH-8.0的Tris-HCl缓冲液平衡15min，流速2.0ml/min;接着送 入100ml 0.25 2.0 mg/ml pH值=5.0 9.0的菠萝蛋白酶溶液，其中氯化钠浓度为0 2.0 mol/L，反应10 100min进行吸附，然后以Tris-HCl缓冲液洗去未吸附上的蛋白质，最后 以洗脱剂进行洗脱，得到菠萝蛋白酶；(4) 测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。所述的步骤(1)中尼龙膜活化是指尼龙膜先在25。Clmol/LHCl中水解24h，然后浸 入20ml甲醛溶液，加入0.2ml85wt.。/o的磷酸，于60。C反应7h， 40 50。C热水洗涤。 所述的步骤(1)中NaOH溶液的浓度为0.1 0.3mol/L。所述的步骤(2)中环氧氯丙垸浓度为95wt%~100wt%，氢氧化钠和碳酸钠溶液的浓度为1 3 mol/L;环氧氯丙垸、氢氧化钠与硼氢化钠的混合溶液中，三者的体积比为0.9~1丄8 11: 0.003 0.005。所述的步骤(2)中洗涤分别用去离子水和4.0vol。/。 8.0vol。/。的醋酸洗涤。 所述的步骤(3)中最佳提纯条件为反应时间为60min， pH=7.0，菠萝蛋白酶的吸附浓度为2.0mg/ml，离子强度为Omol/L的氯化钠溶液，即菠萝蛋白酶溶液中不含氯化钠溶液。所述的步骤(3)中洗脱剂为0.5 1.5mol/L的硫氰酸钠。 有益效果(1) 本专利技术方法操作简单，快速、高效、分离量大，纯化倍数和酶活性较高；(2) 原料来源方便，便于工业大规模提取纯化。 附图说明图1为不同反应时间的菠萝蛋白酶溶液吸附曲线；图2为不同pH的菠萝蛋白酶溶液吸附曲线； 图3为不同浓度的菠萝蛋白酶溶液的吸附曲线； 图4为不同离子强度的菠萝蛋白酶溶液吸附曲线； 图5为利用金属螯合膜吸附菠萝蛋白酶的洗脱曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而 不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1尼龙膜的活化和键合羟乙基纤维素进行改性，具体步骤如下(1) 尼龙膜(10张)先在25'C 1 mol/L HC1中水解24 h，然后用甲醛进行活化。10 张水解的尼龙膜浸入20ml甲醛溶液(>36.5wt.%)，加入0.2ml磷酸(85wt.%)，于60°C 反应7 h， 40-5(TC热水水洗多次。(2) 将上述甲醛活化的尼龙膜(10张)，浸入100ml质量分数为2 %的羟乙基纤维 素溶液，室温反应1 h，然后转入9(TC烘箱，1 h后取出，用1%曲通拉(X—100)的NaOH 溶液(O.lmol/L)洗去未反应的羟乙基纤维素，再在去离子水中清洗2天。实施例2改性后的尼龙膜螯合金属锌离子，具体步骤如下(1) 上述改性后的100张(大约10克)尼龙膜浸入4.6 ml环氧氯丙烷、46 ml 2 mol/L 的氢氧化钠和5mmo1硼氢化钠混和液中，室温反应2 h后，再直接向混和液加入23 ml环 氧氯丙垸、46ml2mol/L的氢氧化钠，60'C反应12h，用去离子水洗多次。(2) 将上述结合环丙垸的10张膜(大约1克)浸入含有86 mmol的亚氦基二乙酸 (IDA)、 8mmo1硼氢化钠和114.4 ml 2 mol/L的碳酸钠的混合溶液，60'C恒温振荡反应12h，用去离子水、5 vol.n/。醋酸和去离子水洗多次。(3) 将上述的膜浸入500mll00ppm的硫酸锌溶液，反应2 h，就可得到螯合锌离子 的金属膜。实施例3用金属螯合膜吸附菠萝蛋白酶，进行条件优化，具体步骤如下 (1)反应时间的确定。将IO张改性尼龙膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入100ml1.0mg/ml菠萝蛋白酶的Tris-HCl溶液(pH=8)，流速为2.0ml/min，分别反应10min， 20 min， 30min， 40min， 50min， 60min， 80min和100min，进行吸附，测定菠萝蛋白酶吸 附的量。实验结果如图l，最适的反应时间选择在60min。(2) 反应pH的确定。将10张改性尼龙膜上叠成膜堆本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法，包括： （１）尼龙膜的改性：活化后的尼龙膜浸入１００ｍｌ １ｗｔ％～３ｗｔ％的羟乙基纤维素溶液中，室温反应１～３ｈ，然后转入烘箱，６０－９０℃烘干１～３ｈ，用１ｗｔ％～３ｗｔ％曲通拉Ｘ－１００聚乙二醇辛基苯基醚的氢氧化钠ＮａＯＨ溶液洗去未反应的羟乙基纤维素，再在去离子水中清洗１～３天； （２）尼龙膜螯合金属锌离子：将上述尼龙膜浸入４～５ｍｌ环氧氯丙烷、４０～５５ｍｌ氢氧化钠和３～６ｍｍｏｌ硼氢化钠的混合溶液中，室温反应１～３ｈ后，加入２０～３０ｍｌ环氧氯丙烷溶液和４０～５０ｍｌ氢氧化钠溶液，继续恒温振荡反应８～１８ｈ，洗涤后再将膜浸入１１０～１２０ｍｌ碳酸钠、６～９ｍｍｏｌ硼氢化钠和８０～９０ｍｍｏｌ偶联剂亚氨基二乙酸ＩＤＡ的混合溶液，５０～７０℃反应１０～１５ｈ，最后浸入５００ｍｌ ５０～１５０ｐｐｍ的硫酸锌溶液，反应１～３ｈ，得到螯合锌离子的金属亲和膜； （３）蛋白酶的吸附洗脱：将金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，以０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ＝８．０的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液平衡１５ｍｉｎ，流速２．０ｍｌ／ｍｉｎ；接着送入１００ｍｌ０．２５～２．０ｍｇ／ｍｌｐＨ值＝５．０～９．０的菠萝蛋白酶溶液，其中氯化钠浓度为０～２．０ｍｏｌ／Ｌ，反应１０～１００ｍｉｎ进行吸附，然后以Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液洗去未吸附上的蛋白质，最后以洗脱剂进行洗脱，得到菠萝蛋白酶； （４）测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱利民，何智妍，聂华丽，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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