本发明专利技术公开了一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３编码的核酸序列，所分离出的ＤＮＡ分子包括：编码具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３活性的多肽核苷酸序列，该核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中从核苷酸第７６７－８７１位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者该核苷酸序列能在４０－５５℃条件下与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中从核苷酸第７６７－８７１位的核苷酸序列杂交。本发明专利技术还同时公开了一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Ｐｐ－ＡＰ３，其具有ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２所示的氨基酸序列。本发明专利技术的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３具有抗菌性能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学、以及基因工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂中表达的抗菌 蛋白Pp-AP3及其编码的核酸序列。
技术介绍
近年来，由于药物的滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日渐严重，现有的抗生素药 物正在失去原来的疗效，从而引发了人们对食品安全的关注，越来越多的国家开始呼吁禁 用抗生素，而抗菌肽(antibacterial p印tides)因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素 的特殊作用机理，已引起人们的极大的研究兴趣，成为分子生物学和生物化学研究领域的 热点之一。各国的研究人员已经从哺乳动物及昆虫、两栖动物等中发现了几百种抗菌肽， 其中有些已经分离提取了出来，并对其结构、抗菌活性等作了许多的研究，发现其抗菌活 性高效、广谱，并且本身无毒、无害，对细菌、病毒、某些原虫、真菌及肿瘤细胞等具有 选择性杀伤作用。自1980年瑞典斯德哥尔摩大学Boman研究小组，首次由大肠杆菌注射诱导处理的惜古 比天蚕蛾滞育蛹血淋巴中提纯得抗菌肽以来，国内外许多学者就昆虫源的抗菌蛋白/肽已做 了大量的筛选、活性测定、基因克隆与表达等工作，且明确昆虫抗菌蛋白/肽可分成天蚕素 (cecropins)、防卫素(defensins)、富含脯氨酸的抗菌肽(prolin-rich antibacterial peptides)和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-rich antibacterial peptides) (Brey & Hultmark, 1998)。作为地球上种类最多的生物，昆虫具有繁殖快、适应性广的特点；除海洋外，所有生 态环境都有昆虫的分布。自19世纪起，昆虫就被作为免疫防卫系统的研究对象。尚存于地 球上的昆虫都是在剧烈的生存竞争中取得胜利后才生存下来的，它们在进化的过程中增强 了抵抗各种病原菌侵染的能力，这就为我们筛选具有抗菌作用的昆虫抗菌蛋白/肽及其目的 基因提供了丰富的基因资源库。众多研究人员从不同的昆虫中发现了数百种抗菌蛋白，但 尚未有任何文献报道从蝶蛹金小蜂中分离得到的抗菌肽。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种具有抗菌性能的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及 其编码的核酸序列。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3编码的核酸序 列，其所分离出的DNA分子包括编码具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3活性的多肽核苷 酸序列，该核苷酸序列与SEQIDNO: 1中从核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70% 的同源性；或者该核苷酸序列能在40-55"C条件下与SEQ ID NO: 1中从核苷酸第767-871 位的核苷酸序列杂交。作为本专利技术的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3编码的核酸序列的改进该序列具有SEQ IDNO: l中第767-871位的核苷酸序列。作为本专利技术的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3编码的核酸序列的进一步改进该序列中 包含8 106个连续核苷酸。本专利技术还同时提供了一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3，其具有SEQIDNO: 2所 示的氨基酸序列。作为本专利技术的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3的改进蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽为 多肽、其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。本专利技术所提供的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及其编码的核酸序列，使其能够应用在蝶 蛹金小蜂中表达的新的抗菌蛋白、编码序列及其在开发成有应用价值的食品添加剂和药物 并应用于农业、工业和食品卫生等多个领域。本专利技术的优点在于本专利技术通过基于cDNA表达性文库的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白/肽基因 的构建及高效克隆筛选方法，以蝶蛹金小蜂为实验材料，筛选其体内表达的抗菌蛋白。该 方法鉴于潜在抗菌蛋白/肽目的表达物能致死本身宿主菌的特点，将潜在抗菌蛋白/肽的蝶 蛹金小蜂的基因的表达与表达物抗菌活性初步测定紧密相合，进行筛选。当筛选到表达物 能使宿主菌死亡的克隆时，也就获得了相应的源于蝶蛹金小蜂的插入之文库中的目的基 因。具有抗菌作用基因的质粒转化入SOLR菌后，在诱导剂IPTG (异丙基-b-d-硫代半乳糖苷)的诱导下基因表达后产生抗菌的蛋白/肽，致使菌体的细胞膜收到破坏，从而允许染料 分子进入细菌细胞，发生显色反应，即观察发现蓝色的克隆。所以，这些被染成蓝色的克 隆就是含有抗菌基因的克隆。将它们挑出后测序，就可得到相应的基因序列及其编码的相 应的抗菌蛋白。本专利技术是通过以下技术方案实现的在本专利技术所分离出的DNA分子包括编码具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1中从核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序 列能在40-55摄氏度条件下与SEQIDNO: 1中从核苷酸第767-871位的核苷酸序列杂交。 较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的 序列具有SEQ ID NO: 1中从核苷酸第767-871位的核苷酸序列。本专利技术分离出的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3包括具有SEQIDNO: 2氨基酸序列的 多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有 SEQIDNO: 2序列的多肽。本专利技术DNA分子包含所述的DNA分子中8-106个连续核苷酸。本专利技术DNA分子转化的宿主细胞是原核细胞。在本专利技术中，"分离的"、"纯化的"DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于 其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而 且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3 (或多肽)编码的核酸序列指编码具有蝶 蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO: 1中第767-871位核 苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO: 1序列编码框第767-871位核 苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密 码的简并性，所以与SEQIDNO: 1中第767-871位核苷酸序列同源性低至约70%的简并 序列也能编码出SEQIDNO: 1所述的序列。还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQIDNO: 1中从核苷酸 第767-871位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQIDNO: 1中从核苷酸第 767-871位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地 至少95%的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3相同功能 的蛋白的SEQ ID NO: 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于) 若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、 插入/或取代，以及在5'和域3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳 地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本专利技术中蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3或多肽指具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的SEQIDNO: 2序列的多肽。该术语还包括具有与天然蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3 相同功能的、SEQIDNO本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３编码的核酸序列，其特征在于所分离出的ＤＮＡ分子包括：编码具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中从核苷酸第７６７－８７１位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在４０－５５℃条件下与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中从核苷酸第７６７－８７１位的核苷酸序列杂交。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：慎小晶，叶恭银，成雄鹰，胡萃，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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