一种中华稻蝗成虫抗菌蛋白的制取方法技术

本发明专利技术属用生物学方法制取抗菌蛋白及其组份提纯的技术领域，特别涉及一种中华稻蝗成虫抗菌蛋白的制取方法。本发明专利技术的抗菌蛋白以中华稻蝗成虫为原料，通过将中华稻蝗成虫提取液经离心、沉淀、分子筛层析、高压液相层析分析、超滤处理、浓缩、收集活力成分等步骤，最后制得。本发明专利技术具有原材料中华稻蝗来源广泛、制取方法简单、回收率高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属用生物学方法制取抗菌蛋白及其组份提纯的领域，特别涉及。
技术介绍
抗菌肽是具有抗菌活性的小分子蛋白质，是生物长期进化过程中保留的先天免疫系统或原生宿主防卫机制中重要的活性分子。抗菌肽在生物界广泛分布。已经在细菌、细菌发酵液、昆虫、鸟类、动物及植物等生物中发现700多中内源多肽类抗菌物质。自1974年瑞典的HG.Boman小组首次从美国天蚕蛹中纯化第一个诱导的昆虫抗菌肽并测定其一级结构后，昆虫免疫机制的研究成为一个非常活跃的领域。昆虫抗菌肽的研究成为免疫学和分子生物学研究的热点。研究的内容包括抗菌肽的分离与纯化、氨基酸序列的分析；蛋白质构型与功能的关系；抗菌肽的作用机理；应用基因工程克隆与表达抗菌肽基因；改造合成抗菌肽基因以及动植物的转抗菌肽基因工程等。昆虫不像高等动物那样有完善专一的免疫体系，缺乏B和T淋巴细胞，没有免疫球蛋白和补体，但是它们有极强的适应能力和防御能力。大量研究表明，昆虫在感染病菌或体壁受到损伤等情况下能够迅速合成一系列低分子量的抗菌蛋白/多肽，杀死病菌并且阻止病菌的继续侵染。昆虫抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性好、抗菌谱广及材料来源丰富等优点，具有广阔的应用前景。到目前为止，从鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、毛翅目、蜚蠊目和蜻蜒目等8个目昆虫中诱导出抗菌物质，已纯化的抗菌物质达200多种。近年来在分子水平的有关抗菌肽的研究主要集中于鳞翅目和双翅目昆虫，其中以天蚕和蝇类的抗菌肽的研究尤为深入。中华稻蝗属直翅目蝗科，其材料来源广泛，但到目前为止，尚未实现中华稻蝗抗菌肽的系统高效分离纯化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种纯度较高的中华稻蝗成虫抗菌蛋白及操作简单的制取方法。本专利技术采用如下的技术方案实现中华稻蝗成虫抗菌蛋白的制取方法，其步骤为1)、采回的中华稻蝗成虫在室内饲养5～10天后，将其去头、足及翅； 2)、置于研钵中加入5～15倍体积预冷的pH6.0～7.0，0.01～0.1mol/L缓冲液，同时加入酶抑制剂于-4℃～20℃温度下研磨，得提取液；3)、将提取液进行4000～20000r/min的离心过程，时间5～30min，收集上清液，于沸水浴中边加热边搅拌5～15min；4)、将搅拌液进行4000～20000r/min的离心过程，时间5～30min，再次收集上清液；5)、将再次收集的上清液浓缩，即得中华稻蝗成虫抗菌蛋白粗提液；6)、粗提液上Sephadex凝胶柱层析，洗脱条件为pH6.0～7.0，0.01～0.1mol/L缓冲液，收集活力峰，并浓缩；7)、将经Sephadex凝胶色谱半纯化的中华稻蝗成虫抗菌蛋白依次装入截流分子量为10KDa、5KDa、3KDa的超滤离心管，在4000～12000r/min条件下离心30min，将纯化物分为4部分，即分子量高于10KDa的组分；分子量介于5～10KDa的组分；分子量介于3～5KDa的组分；分子量低于3KDa的组分；8)、收集3～5KDa的组分，即为中华稻蝗成虫抗菌蛋白。本专利技术所述的，其步骤为1)、采回的中华稻蝗成虫在室内饲养7天后，取其前肠；2)、置于研钵中加入10倍体积预冷的pH6.0，0.01mol/L缓冲液，同时加入酶抑制剂于0℃温度下研磨，得提取液；3)、将提取液进行12000r/min的离心过程，时间15min，收集上清液，于沸水浴中边加热边搅拌10min；4)、将搅拌液进行12000r/min的离心过程，时间10min，再次收集上清液；5)、将再次收集的上清液浓缩，即得中华稻蝗成虫抗菌蛋白粗提液；6)、粗提液上Sephadex凝胶柱层析，洗脱条件为pH6.0，0.01mol/L缓冲液，收集活力峰，并浓缩；7)、将经Sephadex G-25/50半纯化的中华稻蝗成虫抗菌蛋白依次装入截流分子量为10KDa的超滤离心管，在12000r/min条件下离心30min，将纯化物分为4部分，即分子量高于10KDa的组分；分子量介于5～10KDa的组分；分子量介于3～5KDa的组分；分子量低于3KDa的组分；8)、收集3～5KDa的组分，即为中华稻蝗抗菌蛋白。抗菌蛋白F1为白色粉末状，易溶于水、甲醇、乙醇和乙腈，不溶于丙酮和乙醚。本专利技术所述的缓冲液为磷酸或乙酸，各步骤中浓缩方法为超滤浓缩或冷冻干燥浓缩。本专利技术所述方法制取的中华稻蝗抗菌蛋白各项性能的测定试验总结如下1、生理活性测定试验采用两种方法测定抗菌蛋白的生理活性(1)抑菌圈法测定在涂有适量细菌的琼脂板上打孔(直径为2mm)，每孔加入适量样品，37℃培养1～2天.抑菌活性用抑菌圈直径表示(抑菌直径＝总直径-孔直径，mm)。(2)比浊法用0.1mol/L pH6.4的磷酸缓冲液冲洗固体斜面上的检测菌，配成一定浓度的悬浊液(A＝0.2～0.5)，取该悬浊液置于冰浴中，再加入适量纯化抗菌蛋白，混匀，测定其保温前在600nm波长处的光密度值A0，然后将其放入37℃恒温水浴1小时，取出后立刻置于冰浴中5min，中止反应，测其600nm波长处的光密度值A，按U＝(A0-A)/A计算抑菌活力。U为抑菌活力单位。(3)实验结果经测定，中华稻蝗抗菌蛋白可广泛的抑制革兰氏阳性细菌，但对革兰氏阴性细菌没有抑制作用，结果见图1、图2、图3。2、生化特性测定试验(1)热稳定性中华稻蝗抗菌蛋白经沸水浴处理，抗菌物质损失很少，具有很好的热稳定性；(2)pH值稳定性用不同pH溶液处理时，在pH2～13范围内抗菌活力稳定；(3)等电点采用等电聚焦电泳法测定中华稻蝗抗菌蛋白的pI值pI值为8.0～11.0的碱性蛋白；(4)分子量采用凝胶过滤层析法、聚丙烯酰胺垂直板电泳法及激光解吸电离飞行时间质谱法，测得本抗菌蛋白的分子量为3～6KD；结果见图6。本专利技术所述方法制取的中华稻蝗成虫抗菌蛋白，是现有首次从直翅目昆虫中华稻蝗中分离得到的一种抗菌蛋白。本专利技术首先利用其热稳定性强，分子量小的特点，第一步采用沸水浴处理的方法，除去大量的杂蛋白，由此得到中华稻蝗成虫抗菌蛋白的粗品。然后进行分离纯化。首先用分子筛柱层析得到5个峰，峰2、3、4都有抑菌活性，取抑菌作用最强的峰4(F1-4)进行下一步操作。F1-4经截流分子量为10KDa、5KDa、3KDa超滤离心管离心过滤后，最终将纯化物分为4部分，经抑菌活性检测分子量介于3KDa～5KDa的组分具有抑菌作用，该组分即为中华稻蝗成虫抗菌蛋白F1。上述的分离纯化方法，在仪器设备及操作步骤上简单易行。抗菌蛋白纯度较高，产率为0.05～1.7mg/g中华稻蝗成虫。本专利技术相比现有技术具有原材料(中华稻蝗)来源广泛、制取方法简单、产品纯度高等优点。附图说明图1为中华稻蝗成虫抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制结果图2为中华稻蝗成虫抗菌蛋白对藤黄微球菌的抑制结果图3为中华稻蝗成虫抗菌蛋白对枯草芽孢杆菌的抑制结果图4为本专利技术中华稻蝗成虫抗菌蛋白的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。图5为本专利技术中华稻蝗成虫抗菌蛋白的高压液相(HPLC)层析图。图6为中华稻蝗抗菌蛋白MS分析结果具体实施方式实施例是用来说明本专利技术的，而不是对其作任何限制。中华稻蝗成虫抗菌蛋白的制取方法，其步骤为下1、中华稻蝗抗菌蛋白粗提液的制取采回的中华稻蝗成虫在室内饲养7d后，取20头去头、足及翅本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中华稻蝗成虫抗菌蛋白的制取方法，其步骤为：１）、采回的中华稻蝗成虫在室内饲养５～１０天后，将其去头、足及翅；２）、置于研钵中加入５～１５倍体积预冷的ｐＨ６．０～７．０，０．０１～０．１ｍｏｌ／Ｌ缓冲液，同时加入酶抑制剂于－４℃～２０℃温度下研磨，得提取液；３）、将提取液进行４０００～２００００ｒ／ｍｉｎ的离心过程，时间５～３０ｍｉｎ，收集上清液，于沸水浴中边加热边搅拌５～１５ｍｉｎ；４）、将搅拌液进行４０００～２００００ｒ／ｍｉｎ的离心过程，时间５～３０ｍｉｎ，再次收集上清液；５）、将再次收集的上清液浓缩，即得中华稻蝗成虫抗菌蛋白粗提液；６）、粗提液上Ｓｅｐｈａｄｅｘ凝胶柱层析，洗脱条件为ｐＨ６．０～７．０，０．０１～０．１ｍｏｌ／Ｌ缓冲液，收集活力峰，并浓缩；７）、将经Ｓｅｐｈａｄｅｘ凝胶色谱半纯化的中华稻蝗成虫抗菌蛋白依次装入截流分子量为１０ＫＤａ、５ＫＤａ、３ＫＤａ的超滤离心管，在４０００～１２０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心３０ｍｉｎ，将纯化物分为４部分，即分子量高于１０ＫＤａ的组分；分子量介于５～１０ＫＤａ的组分；分子量介于３～５ＫＤａ的组分；分子量低于３ＫＤａ的组分；８）、收集３～５ＫＤａ的组分，即为中华稻蝗成虫抗菌蛋白。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄登宇，宋强，李婷，邢志国，赵立苹，
申请(专利权)人：山西中医学院，
类型：发明
国别省市：14[中国|山西]