一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种脂肪酶凝胶颗粒及其制备方法。本发明专利技术所提供的脂肪酶凝胶颗粒由核心和核壳组成，所述核心为脂肪酶，所述核壳为由乙烯基单体聚合而成的高分子材料，所述核心和核壳之间通过化学键连接。本发明专利技术的脂肪酶凝胶颗粒具有活性高、热稳定性强、耐有机溶剂能力强、粒径小、比表面积高、无传质扩散阻力等特点。这种脂肪酶凝胶颗粒作为一种高性能的纳米酶制剂，将在纳米科学和生物技术等领域具有广阔的应用前景。本发明专利技术的制备脂肪酶凝胶颗粒的方法具有反应条件简单温和、制成的凝胶颗粒粒径可控制和易于工业实施放大的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
脂肪酶(lipase)是目前最重要、应用最为广泛的水解酶，可以水解含有酯键的 物质，同时也可以在有机相中催化合成酯类物质。脂肪酶反应条件温和、活性高、 来源容易、成本较低，在有机合成、食品工业、洗涤剂工业、能源工业、生物转化、 生物医药、生物传感器等领域均有广泛的用途。天然脂肪酶的稳定性包括热稳定性、 有机相活性和有机相稳定性，是脂肪酶的主要限制性因素，难以满足实际应用的需 求。5(TC时，大多数脂肪酶活性的半衰期只有30分钟左右，在一些强极性的有机 溶剂和水溶液组成的混合体系中，其稳定性更差。因此，采用化学手段、生物工程 手段来提高脂肪酶的稳定性对拓展脂肪酶在各方面的应用具有重要的意义。化学修饰方法成本低、方法简单，近年来在酶分子的改造中得到了广泛应用。 目前，化学添加剂方法、固定化方法、基因工程等方法均能够提高酶分子的稳定性， 但是，添加剂方法需要加入大量的添加剂，会给反应体系带来新的杂质和干扰；传 统的固定化方法会引入较高的传质阻力，带来酶催化活性的显著下降；而基因工程 方法较为复杂、成本较高、对稳定性提高的效果有限、无法解决大量廉价生产的问 题。因此开发一种具有高稳定性、高生物催化活性、易于实施、粒径可控制的脂肪 酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒具有重大的应用价值，可以解决现有的脂肪酶热稳 定性差、耐有机溶剂能力低的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术所提供的脂肪酶凝胶颗粒具有脂肪酶的生物催化活性，以脂肪酶、酶修 饰剂、乙烯基单体和引发剂为原料，通过自由基聚合制备得到。本专利技术的脂肪酶凝胶颗粒由核心和核壳组成，所述核心由脂肪酶组成，所述核 壳由高分子组成，所述高分子由乙烯基单体聚合而成，所述核心和核壳之间通过酶 修饰剂连接，所述酶修饰剂为至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与所述脂肪酶反 应形成化学键的物质。所述酶修饰剂优选为丙烯酸琥珀酰亚胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴、衣康酸酯和衣康酸酐中的至少一种。所述脂肪酶凝胶颗粒的核心的粒径为5-10 nm，优选为5 — 7nm;所述脂肪酶凝胶颗粒的粒径为10-80 nm，优选为25 — 50nm。上述脂肪酶凝胶颗粒的制备方法包括以下步骤1) 将脂肪酶与酶修饰剂加入到pH为4一9.4的缓冲液中，0 — 5(tc条件下反应 0.5—6小时，将反应液进行透析，以去除酶修饰剂；2) 将上述步骤1)透析后的溶液加入到有机溶剂的水溶液中，然后再加入乙烯 基单体和引发剂，0 — 50。c下反应0.5—6小时，得到脂肪酶凝胶颗粒。上述方法中，所述步骤l)中的反应温度为4一30。c，反应时间为4一6 h;所 述步骤2)中的反应温度为0 — 5(tc,反应时间为0.5 — 2h。上述方法中，所述酶修饰剂为至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与所述脂肪 酶反应形成化学键的物质，优选为丙烯酸琥珀酰亚胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴、衣 康酸酯和衣康酸酐中的至少一种。所述乙烯基单体为可通过自由基聚合反应形成聚合物的物质，优选为丙烯酰 胺、丙烯酸、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙 酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、a^v'-甲叉双丙烯酰胺、顺 丁二烯和三羟基甲基丙垸三甲基丙烯酸酯中的至少一种。所述引发剂为0 — 50。c条件下，能够引发产生自由基并使所述乙烯基单体发生 自由基聚合的热引发或氧化还原引发物质，优选为由过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化 氢、叔丁基过氧化氢和过氧化苯二甲酰中的至少一种与亚铁盐、亚硫酸盐、auv'-二甲基苯胺、氨水、auv'-二甲基-对甲苯胺、a/;a^v'，w'-四甲基乙二肢、哌啶和w-甲基吗啉中的至少一种组成的复合引发剂。上述方法中，所述步骤l)中，加入的脂肪酶的重量份数为10份，所述步骤 1)中，加入的酶修饰剂的重量份数为2—40份，所述步骤2)中，加入的乙烯基单 体的重量份数为20—200份，所述步骤3)中，加入的引发剂的重量份数为0.5—20 份。上述方法中，所述步骤1)中的缓冲液为由乙酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷 酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸钠、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、 碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾中的至少一种与其相应的酸组成的水溶液。所述步骤2)中的有机溶剂水溶液为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、二氧六环、乙腈、乙醇和丙酮中的至少一种有机溶剂的水溶液。所述有机溶剂的水溶液 中，所述有机溶剂的质量百分含量为0.5—10%。本专利技术所提供的脂肪酶纳米凝胶颗粒具有较高的生物催化活性，由于脂肪酶与 外壳高分子之间共价连接，能够显著强化脂肪酶的结构，从而有效阻止了高温下脂肪酶的结构振动而导致的失活问题；同时外壳连接的亲水性高分子材料层可以有效 的保持脂肪酶分子表面的结构必需水，这些结构必需水的有效保持显著改善了脂肪 酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒在极性有机溶剂水溶液中的活性和稳定性；并且由 于脂肪酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒的粒径处于纳米范围、外壳连接的高分子材 料层薄至几个到几十纳米，因此对酶催化反应的底物传质物无明显的影响。本专利技术所述的脂肪酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒具有活性高、热稳定性强、 耐有机溶剂能力强、粒径小、比表面积高、无传质扩散阻力等特点。这种纳米高分 子材料生物催化凝胶颗粒形式的脂肪酶作为一种高性能的纳米酶制剂，在纳米科学 和生物
具有广泛的应用前景。本专利技术的方法具有反应条件简单温和、粒径 尺度可控、易于工业实施放大的特点。 附图说明图1为脂肪酶凝胶颗粒的透射电镜图 图2为脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶的热稳定性对比图 图3为脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶在甲醇水溶液中的稳定性对比图 图4为脂肪酶凝胶颗粒和天然脂肪酶在二甲基甲酰胺水溶液中的稳定性对比图 具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术的脂肪酶纳米高分子生物催化凝胶颗粒及其制备方 法予以进一步说明，但不限制本专利技术。实施例中用于化学修饰的脂肪酶来源于商品 酶、动物提取物或微生物提取物。实施例1、脂肪酶凝胶颗粒的制备、活性检测和稳定性检测1、脂肪酶凝胶颗粒的制备1)将10g脂肪酶(购自Sigma公司，美国，皱褶假丝酵母脂肪酶)与2g丙烯 酸琥珀酰亚胺酯(酶修饰剂，购自Sigma公司，美国)加入到200 mL pH为4的 100 mM乙酸缓冲液(24.5mg三水合乙酸钠和49mg乙酸溶解于200mL水)中，20°C 条件下反应6小时，将反应液装入截留分子量为1万的透析袋中，在水中透析24 小时，每隔6小时换水一次，去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯；2) 将上述步骤1)的去除丙烯酸琥珀酰亚胺酯的反应液加入到200mL2。/。(质 量百分含量)二甲基亚砜的有机溶剂水溶液中，然后再在反应液中加入20g丙烯酰 胺(乙烯基单体)，以及由4g过硫酸铵和6g7V;AUV',A^四甲基乙二胺组成的引发 剂，3CTC条件下反应2小时;3) 将上述步骤2)的反应液装入截留分子量为1万的透析袋中，在水中透析 24小时，每隔6小时换水一次，冻干得到29g脂肪酶凝胶颗粒。2、 脂肪酶凝胶颗粒的活性检测和结构表征以对硝基酚棕榈酸酯(购自Sigma公司，美国)作为底物测定上述获得的脂肪 酶凝胶颗粒的生物催化活性总收率，同时采用体积排阻色谱法检测脂肪酶凝胶颗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪酶凝胶颗粒，它由核心和核壳组成，所述核心由脂肪酶组成，所述核壳由高分子组成，所述高分子由乙烯基单体聚合而成，所述核心和核壳之间通过酶修饰剂连接，所述酶修饰剂为至少含有一个碳碳不饱和双键且可以与所述脂肪酶反应形成化学键的物质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戈钧，刘铮，卢滇楠，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]