本发明专利技术涉及对样品中存在的、优选来自病原体感染的个体的样品中存在的任何病原体的多种变体（毒株）进行核酸扩增的方法。在优选实施方案中，病原体是逆转录病毒，如ＨＩＶ。所扩增的病原体核酸可以用于鉴定样品中存在的病原体变体，定量样品中存在的病原体，以及作为核酸疫苗，或者用于制备抗原呈递细胞疫苗。通过本发明专利技术的方法产生的核酸或者其编码的蛋白质可以用于转染／庄在抗原呈递细胞。经装载的抗原呈递细胞然后可以用作治疗病原体感染的疫苗。在另一实施方案中，通过本发明专利技术方法产生的核酸可以直接用作核酸疫苗而不用先装载进抗原呈递细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及病原体的非毒林依赖性(strain-independent)扩增， 还涉及患者特异性疫苗和相关组合物。本专利技术的优选实施方案涉及针 对逆转录病毒(如HIV和HCV)的患者特异性疫苗。
技术介绍
许多病原体快速突变和重组，使得难以产生有效的疫苗。该问题 在病毒病原体，尤其在RNA病毒，如HIV病毒中极其普遍。HIV感 染的个体可以含有多种HIV毒林并且通常含有多个HIV准种 (quasispecies ) 针对治疗受病原体如HIV - 1感染的个体的治疗策 略面临巨大的难题从抗病毒剂抗性的病毒毒林的发展，到这些药物的许多副作用，使得连续施用这些治疗极端困难和昂贵。已经开发了一些治疗性H1V疫苗，然而，这些疫苗的临床试验显 示出很小的功效。关于这些疫苗没有成功的一种解释是使用了包括 HIV病毒基因组的共有序列的病毒栽体作为免疫原.共有序列的存在 不一定支持所述序列在引起针对异源病毒的免疫应答中的功效，因为 共有序列和自体感染性HIV毒林之间分歧的水平仍然很高并且不断升 高，所以基于HIV-1亚型B共有序列的疫苗或者抗病毒试剂不足以治 疗HIV感染。此外，看起来可能出现下述情况那些基于病毒栽体的 疫苗不靶定在抗原加工和呈递方面最有效的免疫系统细胞，即树突细 胞。许多出版物已经提出使用栽有HIV核酸或者肽的抗原呈递细胞 作为HIV疫苗。例如，Huang爭入(J Infect. Dis. 2003 187: 315-319) 公开了栽有与脂质体复合的HIV蛋白质的树突细胞，以及可能使用此 类经装栽的细胞作为疫苗。Weissman爭乂 (J Imimmol 2000 165: 4710-4717)公开了用编码单一克隆的HIV gag序列的mRNA转染树突 细胞，导致向I和H类MHC分子递送抗原性gag肽，以及在体外诱 导CD4+和CD8+ T细胞应答。U.S. 5，853,719和U.S. 6,670,186 (Nair爭 乂)描述了由从患者分离的肿瘤或者病原体获得的RNA用于体外装栽自体抗原呈递细胞的用途，和它们作为疫苗的用途.然而，用栽有总病原体RNA的抗原呈递细胞接种患者可以增加患者中的病原体负荷。早已认识到了下述过程中的困难选出能够从给定抗原的所有变 体，尤其是HIV的所有变体扩增核酸的引物.在体内病毒和免疫选择 的低保真度逆转录酶引起的HIV基因组的高突变率，使得HIV基因 组的特定区域的扩增复杂化。然而，已经开发了可以从多种HIV变体 扩增HIV基因组的某些区域的引物。例如，Abravaya爭乂 (J Clinical Microbio 2000 38: 716-723)公开了 HIV-l特异的和HIV-2特异的引 物和靶定pol基因中保守序列的探针，用于多路PCR测定法，以检测 血浆中的HIV-l组M亚型A、 B、 C、 D、 E、 F和G，和组O和HIV-2 RNA，还公开了此类测定法用于提高血液供应的安全性的用途.Christopherson爭乂 (Nucleic Acids Res 1997 25: 654-658)讨论 了内部引物-HIV-l模板错配对用于扩增gag的142个碱基对区域的 RT-PCR的影响。在HIV-l模板和长28-30个碱基的引物之间的5 到6个错配(但不是2到4个错配)会显著降低RT-PCR的产率.引 物被设计为比通常使用的更长以便容纳错配.通过降低退火温度到 50。C并实现逐渐升高温度的逆转录步骤，可以使更趋异的HIV-l亚 型A和E的扩增的降低的效率提高4倍到IO倍.而且，用5-甲基胞 嘧啶替代胞嘧啶，或者在可变碱基位置用次黄嚷呤取代，导致同源的 和更趋异的HIV-l模板之间产物产率相差4倍以下。以T终止的引物 允许在与C、 G或者T匹配或者错配时进行扩增。Michael等人(J Clin Microbiol 1999 37: 2557-2563)公开了用于 扩增HIV-l gag基因的155个核苷酸序列的引物.选择引物以使得与 亚型A到G的30种HIV-l分离物的同源性最大化，并且使得HIV-l 与接近该引物的3，末端的引物错配最小。在扩增期间退火温度降低以 增加错配耐受性。与以前可获得的测试相比，优化的引物和扩增条件 提高了所检测的HIV-l RNA的量，但是降低了亚型A、 D、 F和G， 并且不含有亚型H和J的成员.U.S. 6,001,558公开了下述过程使用多种引物扩增来自多个 HIV-l分离物的LTR和pol区的短片段(<200个碱基对)，以及来自 多个HIV-2分离物的LTR、 pol和env的短片段(<200个碱基对).然后用多种探针检测扩增产物.引物/探针组合能够检测来自组M和 0的5种HIV-l分离物和两种HIV-2分离物，通过如下标准，选择 对应于HIV-1的高度保守序列的引物1)扩增的PCR产物的长度不 能超过200个碱基对，因为较小的产物比更大的产物能更有效地扩增， 并且对其它反应条件较不敏感；2)引物组必须扩增功能探针区以检 测扩增产物；3)引物的3，末端的错配将比5'末端附近的错配远不优 选；和4)3'末端稳定性、长度(约23 -32个核苷酸)、GC含量和与 其它引物和探针相互作用的其它标准。U.S. 6，194，142公开了使用下述引物对体外诊断HIV-1、 HIV-2和 SIV感染的方法，所述引物对对应于在HIV-1 Bru、HIV-l Mal和HIV-l Eli、HIV-2 ROD和SIV MAC毒林的gag、po1和env基因之间和HIV-2 ROD和SIV MAC的nef2、vif2和vpx之间或者HIV-1 Bm、HIV-1 Mai 和HIV-1 Eli的env、 nefl、 vifl和vpr基因之间保守的序列.具有 与HIV变体和SIV对应的变异核苷酸的引物混合物同时用于PCR反 应中。U.S. 6,232,455公开了来自31种HIV-1组M (亚型(A， B和D)和 组O分离物和HIV-2 A和B亚型的14种分离物的共有序列的引物/ 探针组。HIV-1共有引物/探针组对HIV-1的检测特异，而HIV-2共 有引物/探针组对HIV-2的检测特异。U.S. 6，531，588公开了用于扩增来自患者中多个HIV准种的pol 的0.7 kB、 1.57 kb或2.1 kb区的引物，接种测序以确定患者特异的 HIV基因型信息，其用于确定合适的疗法和检测药物抗性.U.S. 2003/0148280公开了用于检测据称所有HIV-1组M、 N和 O毒林的引物组和探针，所述毒林包括循环的重组形式(CRF，其指 亚型之间的重组体)和组间重组体。引物把定HIV-1 gag p24 (399 bp 扩增子)、pol整合酶(864 bp扩增子)，和env gp41免疫显性区(IDR; 369 bp扩增子)。这些出版物没有一份提出可能使用扩增的自体病原体核酸制备抗 原呈递细胞疫苗或者核酸疫苗，所述核酸编码个体中存在的病原体的 多个种的特定多肽.本专利技术解决了长期感受到的、对开发用来治疗自 体感染病原体的患者特定疫苗的需要，并提供了類外优点，专利技术枇述申请人已经发现了下述核酸扩增方法，其用于扩增样品(优选 来自病本文档来自技高网...
【技术保护点】
分离的抗原呈递细胞（ＡＰＣ），其包含编码一种或多种多肽的核酸，所述多肽来自个体受试者中存在的病原体的一种或多种毒株，其中一种或多种病原体多肽不由任何毒株所表现。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：C尼古列特，I切尔帕诺瓦，J哈里斯，D赫利，
申请(专利权)人：阿戈斯治疗公司，麒麟麦酒株式会社，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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