一种饮用水中隐孢子虫的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种饮用水中隐孢子虫的检测方法及试剂盒，本发明专利技术采用盘式过滤器过滤截留饮用水中微生物‑‑丙酮溶解滤膜‑‑磷酸盐沉淀微生物‑‑冻融前处理和蛋白酶破坏卵囊外部结构‑‑离心得到上清液，上清液用于直接提取卵囊DNA，进行qPCR基因定量。采用本发明专利技术的检测方法检测饮用水中隐孢子虫无假阳性出现，结果准确可靠，特异性强，而且可以检测到10个SSUrRNA基因拷贝，灵敏度高，检测结果快，实验成本低，采用该检测方法测定的去离子水和地下水源水中隐孢子虫的加标回收率分别达到了55％和46％。

A detection method and kit for Cryptosporidium in drinking water

Detection method and reagent kit of the invention discloses a Cryptosporidium in drinking water, the invention adopts disc filter filtration in drinking water microbial acetone dissolved membrane phosphate precipitation microbial freeze-thaw pretreatment and destruction of the external structure of protease oocysts from experience to supernatant supernatant was used for direct extraction of DNA oocysts. QPCR gene quantitative. The detection method of the invention of the detection of Cryptosporidium in drinking water and no false positive, accurate and reliable, strong specificity, and can detect 10 SSUrRNA gene copies, high sensitivity, fast detection results, the cost is low, and the recovery of deionized water using the detection method of determination of Cryptosporidium in water and underground water the rate reached 55% and 46%.

【技术实现步骤摘要】
一种饮用水中隐孢子虫的检测方法及试剂盒
本专利技术涉及环境监测及微生物分子检测
，具体涉及一种饮用水中隐孢子虫的检测方法及试剂盒。
技术介绍
隐孢子虫引起的隐孢子虫病害可通过饮用水传播，对人类健康具有重大威胁，尤其对免疫力低下者可引发致死性腹泻。直径在4-6μm隐孢子虫厚壁卵囊能抵抗常规水处理中的次氯酸消毒并在水中存活数月，而且在4℃水中保存13个月仍然具有感染活性[陈甫,2008.动物隐孢子虫的分子流行病学、致病机理与抗感染药物的研究[D].南京农业大学博士学位论文.]，饮用水中隐孢子虫的检测可以预防病害流行与发生，保证饮用水水质安全。目前国内及国际上生活饮用水中隐孢子虫的检测主要依据免疫磁珠分离和荧光显微镜镜检[崔艳梅,王云霞,段效辉,等.2016.水环境中贾第鞭毛虫和隐孢子虫检测方法的研究进展[J].食品安全质量检测学报,7(4):1369-1374；余素华，陈贻球,严锦玲.2009.免疫荧光法测定水中贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊[J].环境监测管理与技术，21(1):33-35；KingD.N.,DonohueM.J.,VesperS.J.,etal.2016.MicrobialpathogensinsourceandtreatedwatersfromdrinkingwatertreatmentplantsintheUnitedStatesandimplicationsforhumanhealth[J].ScienceoftheTotalEnvironment,562:987-995.]，这也是我国GB/T5750国标和美国EPA隐孢子虫检测的标准方法，该方法采用免疫磁分离试剂分离卵囊，并使用免疫荧光技术进行染色镜检，其中显微镜镜观察比较依赖人的主观判断，某些荧光抗体的背景信号高、特异性低，容易引起结果不准确[Lemos,V.,Graczyk,T.,Alves,M.,etal.2005.IdentificationanddeterminationoftheviabilityofGiardialambilacystsandCryptosporidiumparvumandCryptosporidiumhominisoocystsinhumanfecalandwatersupplysamplesbyfluorescentinsituhybridization(FISH)andmonoclonalantibodies[J].ParasitologyResearch,98,48-53；Quintero-BetancourtW.2003AssessmentofCurrentandNewMethodsforInvestigatingtheOccurrenceofEntericPathogensinAmbientWatersandWaterSourcesforRehydrationofaFloridaWetland.UniversityofSouthFlorida,2003.]，而且免疫磁分离试剂价格昂贵，限制了该方法的广泛应用。分子生物学的发展推动了分子技术在病原体检测诊断中的应用，近年来正在发展分子方法检测隐孢子虫，分子方法检测速度快，灵敏性高，选用不同的目标基因进行扩增，测定样品的阳性率或者进行qPCR基因定量[顾有方，汪凯，刘德义，等.2015.宠物犬蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫感染的分子检测[J].(33)5:362-367；ChalmersRMandKatzerF.2013.LookingforCryptosporidium:theapplicationofadvancesindetectionanddiagnosis[J].TrendsinParasitology,29(5):237-251；ChalmersR.MandKatzerF.2013.LookingforCryptosporidium:theapplicationofadvancesindetectionanddiagnosis[J].TrendsinParasitology,29(5).]，但是目前饮用水或水源水中隐孢子虫分子检测还没有发展出成熟的可接受的方法，在样品前处理等方面仍然存在一定的问题。当采集样品较量低时(低于2.5L)，通常使用47mm左右滤膜过滤，通过剪碎滤膜来直接提取样品DNA，进而对隐孢子虫基因定量分析[Guy,R.A.,P.Payment,U.J.Krull,andP.A.Horgen.2003.Real-timePCRforQuantitationofGiardiaandCryptosporidiuminenvironmentalwatersamplesandsewage[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiolology,69:5178–5185；王明星,柏耀辉,梁金松,等.2016.应用FCM-qPCR方法定量检测水中常见病原体[J].环境科学，26(1):384-390.]，采集的样品体积量较低，因此也相应的减少了DNA含量，导致检测的范围缩小，不能正确指示受隐孢子虫污染情况。当采集样品量较多(高于5L时)，目前大多报道仍是依赖于免疫磁分离的方法分离卵囊[AlmeidaA,MoreiraM,SoaresS,DelgadoM,FigueiredoJ,SilvaE,CastroACostaAandCostaJ.2010.BiologicalandGeneticCharacterizationofCryptosporidiumspp.AndGiardiaduodenalisisolatesfromfivehydrographicalbasinsinNorthernPortugal.KoreanJParasitol.,48(2):105-111；HelmiK,SkraberS,BurnetJ,LeblancL,HoffmannLandCauchieH.2011.Two-yearmonitoringofCryptosporidiumparvumandGiardialambliaoccurrenceinarecreationalanddrinkingwaterreservoirusingstandardmicroscopicandmolecularbiologytechniques.EnvironMonitAssess,179:163–175；XiaoL.AlderisioK.andJiangJ.2006.DetectionofCryptosporidiumooocystsinwater:effectofthenumberofsamplesandanalyticreplicatesontestresults[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,72(9):5942–5947.]，实验成本较高而不利于广泛应用。因此，建立成熟可靠的饮用水中隐孢子虫的分子检测方法也迫在眉睫。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种饮用水中隐孢子虫的检测方法及试剂盒，采用本专利技术的检测方法检测饮用水中隐孢子虫，结果准确可靠，特异性强，而且可以检测到10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)饮用水的前处理采用过滤器过滤饮用水，过滤器内的滤膜截留饮用水中微生物，然后采用有机溶剂溶解滤膜，待滤膜完全溶解后，加入缓冲液沉淀微生物，离心回收沉淀物；(2)水样DNA提取将沉淀物涡旋后形成悬浮物，加入裂解液进行冻融前处理，冻融前处理完成后加入蛋白酶用于破坏隐孢子虫卵囊外部结构，离心取上清液，上清液用于提取隐孢子虫卵囊DNA；(3)qPCR检测采用qPCR方法对隐孢子虫卵囊DNA进行扩增，根据扩增结果判断饮用水中是否感染了隐孢子虫，并能确定感染量。

【技术特征摘要】
1.一种饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)饮用水的前处理采用过滤器过滤饮用水，过滤器内的滤膜截留饮用水中微生物，然后采用有机溶剂溶解滤膜，待滤膜完全溶解后，加入缓冲液沉淀微生物，离心回收沉淀物；(2)水样DNA提取将沉淀物涡旋后形成悬浮物，加入裂解液进行冻融前处理，冻融前处理完成后加入蛋白酶用于破坏隐孢子虫卵囊外部结构，离心取上清液，上清液用于提取隐孢子虫卵囊DNA；(3)qPCR检测采用qPCR方法对隐孢子虫卵囊DNA进行扩增，根据扩增结果判断饮用水中是否感染了隐孢子虫，并能确定感染量。2.根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述滤膜为1～2μm孔径的混合醋酸纤维素滤膜，所述过滤器为盘式过滤器，所述有机溶剂为丙酮；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求2所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，采用丙酮溶解滤膜的具体步骤为：收集滤膜于离心管中，加入丙酮，离心弃上清液，继续加入丙酮，再离心取沉淀，重复此操作2～3次，直至滤膜完全溶解。4.根据权利要求2所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，在收集滤膜之前还包括以下步骤：依次用PBST缓冲液、体积分数为70％～100％的乙醇、超纯水清洗过滤器。5.根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述裂解液为ATL裂解液，所述裂解液与所述悬浮物的体积比为2.25:1；所述冻融前处理为在液氮和沸水中反复冻融5次，每次冻融为在液氮中2min，在沸水中2min。6.根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述蛋白酶为蛋白酶K，所述蛋白酶K与EP管中混合液的体积比为1:10；加入蛋白酶用于破坏隐孢子虫卵囊外部结构的具体步骤为：冻融前处理完成后加入蛋白酶K，55～60℃下水浴2.5～3.5h，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红岩，杨敏，李春格，李罗英，于志勇，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11