芸苔属事件LBFLFK和LBFDAU及其检测方法技术

本发明专利技术提供转基因芸苔属事件LBFLFK和LBFDAU及其后代，和包含这些事件的诊断性DNA的细胞、种子和植物。本发明专利技术也提供人工寡核苷酸引物和探针，其可以用于在样品中诊断LBFLFK事件和LBFDAU事件及其后代；并提供在样品中检测LBFLFK事件和LBFDAU事件及其后代的存在的方法。本发明专利技术还提供衍生自LBFLFK事件和LBFDAU事件的油和商业产品。

Brassica LBFLFK and LBFDAU event and its detection method

The present invention provides transgenic Brassica LBFLFK and LBFDAU and their progeny cells, seeds and plants and contain diagnostic DNA of these events. The invention also provides artificial oligonucleotide primers and probes, which can be used to diagnose LBFLFK events and LBFDAU events and their offspring in samples, and to provide methods for detecting LBFLFK events and LBFDAU events and their offspring in samples. The invention also provides oil and commercial products derived from LBFLFK events and LBFDAU events.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】芸苔属事件LBFLFK和LBFDAU及其检测方法本申请要求2014年11月14日提交的美国临时专利申请序列号62/079,622和2015年9月29日提交的美国临时专利申请序列号62/234373的优先权，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。作为本公开的组成部分，序列表作为文本文件与本说明书同时提交。序列表的主题通过引用的方式完整并入本文。
本专利技术涉及生物技术和农业领域，并且更具体地，涉及包含事件LBFLFK或事件LBFDAU的转基因芸苔属植物、其后代植物、种子和从中衍生的油和粕(meal)。本专利技术还涉及用于检测生物样品中存在事件LBFLFK或事件LBFDAU的方法，所述方法利用每个事件独有的核苷酸序列。专利技术背景近年来已经日益确立了极长链多不饱和脂肪酸(“VLC-PUFA”或“PUFA”)对人类和动物营养的健康益处。特别地，ω3PUFA二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)在神经发育、免疫应答和炎症反应中发挥作用。此外，含有EPA和DHA的膳食补充剂用来减轻心血管和神经学病变，并且可以用于治疗一些癌症。EPA和DHA的当前商业来源是鱼油。但是，海洋储备正在削减，并且需要EPA和DHA的备选来源以满足日益增长的需求。已经做出许多努力以开发产生VLC-PUFA(包括EPA和DHA)的转基因油籽植物。参见，例如，WO2004/071467、WO2013/185184、WO2015/089587，Ruiz-Lopez等人,(2014)PlantJ.77,198-208。但是，以商业意义的水平产生EPA和DHA的转基因油籽植物尚未商业化。已经在WO2001/059128、WO2004/087902和WO2005/012316中描述了编码显示出Δ-6-延伸酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自展叶剑叶藓(Physcomitrellapatens)的这种酶。已经在WO2002026946和WO2003/093482中描述了编码显示出Δ-5-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自破囊壶菌属物种(Thraustochytriumsp.)的这种酶。已经在WO2005/012316、WO2005/083093、WO2006/008099和WO2006/069710中描述了编码显示出Δ-6-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自托瑞蚝球藻(Ostreococcustauri)的这种酶。已经在WO2005/012316、WO2005/007845和WO2006/069710中描述了编码显示出Δ-6-延伸酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)的这种酶。已经例如在WO2006100241中描述了编码显示出Δ-12-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自大豆疫霉(Phytophthorasojae)的这种酶。已经在WO2005/012316和WO2007/096387中描述了编码显示出Δ-5-延伸酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自托瑞蚝球藻的这种酶。已经例如在WO2008/022963中描述了编码显示出ω3-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自畸雌腐霉(Phytiumirregulare)的这种酶。已经例如在WO2005012316和WO2005083053中描述了编码显示出ω3-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自致病疫霉(Phytophthorainfestans)的这种酶。已经例如在WO2002026946中描述了编码显示出Δ-4-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自破囊壶菌属物种(Thraustochytriumsp.)的这种酶。WO2003078639和WO2005007845中描述了编码来自路氏巴夫藻(Pavlovalutheri)的Δ-4去饱和酶的多核苷酸。已知外来基因构建体在植物中的表达受插入基因的染色体位置影响，并且转基因构建体在植物基因组中不同位置处的存在可能影响内源基因表达和植物的表型。由于这些原因，需要筛选大量从特定构建体产生的转基因事件，旨在鉴定一个或多个供商业化的“原种”事件(eliteevents)，所述的原种事件显示出最佳的转基因表达，而无不利特征。原种事件具有所需水平和样式的转基因表达，并且可以用于将转基因构建体通过常规育种方法经有性远交而渐渗至有商业意义的遗传背景中。这类杂交的后代维持原始原种事件的转基因构建体表达特征。使用这种策略可以在适应于本地生长条件的大量品种中确保可靠的基因表达。为了渐渗(introgression)、解除管制和质量控制目的，必需能够检测原种事件中转基因构建体的存在，在有性杂交的后代中和在其他植物中均如此。此外，也可以监测谷物、粕和食品中转基因构建体的偶然存在以确保符合监管要求。可以使用已知的核酸检测方法如聚合酶链反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交，检测转基因构建体的存在。这些检测方法可指向频繁使用的遗传元件，如启动子、终止子、标记基因等。这些方法可能无法用于区分含有相同遗传元件的不同事件，除非还已知与插入的构建体毗邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列。对于众多的已经商业化的基因修饰产品，事件特异性测定试验是已知的。负责批准包含特定原种事件的转基因植物使用的监管机构也要求事件特异性检测试验。转基因植物事件-特异性测定试验在例如美国专利号6,893,826；6,825,400；6,740,488；6,733,974；6,689,880；6,900,014；6,818,807；和8,999,411中已有描述。专利技术概述在一个实施方案中，本专利技术提供包含转基因芸苔属事件LBFLFK的芸苔属植物，所述事件LBFLFK以ATCC名称“PTA-121703”保藏。芸苔属事件LBFLFK含有双元T-质粒VC-LTM593-1qczrc的两个插入，所述插入命名为LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2。此实施方案的芸苔属植物包括与芸苔属事件LBFLFK不可区分的后代(所述不可区分的限度为后代还可以含有至少一个与LBKLFK基因座1或LBFLFK基因座2相对应的等位基因)。此实施方案的芸苔属植物包含独特于每个LBFLFK插入的基因组DNA/转基因接头点和因此独特的接头区域：对于LBFLFK基因座1，接头区域具有至少SEQIDNO:4的多核苷酸序列或至少SEQIDNO:5的多核苷酸序列；对于LBFLFK基因座2，接头区域具有至少SEQIDNO:13的多核苷酸序列或至少SEQIDNO:14的多核苷酸序列。在此实施方案中还包括从芸苔属事件LBFLFK及其后代衍生的种子、植物部分、植物细胞和植物产品。在另一个实施方案中，提供针对每个LBFLFK插入检测芸苔属事件LBFLFK基因组DNA/转基因接头区域存在的组合物和方法：对于LBFLFK基因座1，接头区域具有至少SEQIDNO:4的多核苷酸序列或至少SEQIDNO:5的多核苷酸序列；对于LBFLFK基因座2，接头区域具有至少SEQIDNO:13的多核苷酸序列或至少SEQIDNO:14的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本专利技术提供从芸苔属事件LBFLFK和/或其后代产生的商业产品，本文档来自技高网...

【技术保护点】
芸苔属植物，其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.14 US 62/079,622;2015.09.29 US 62/234,3731.芸苔属植物，其包含SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:13和/或SEQIDNO:14。2.芸苔属种子，其包含SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:13和/或SEQIDNO:14。3.包含事件LBFLFK的芸苔属植物或种子，其中包含转化事件LBFLFK的种子样品已经以ATCC保藏号PTA-121703保藏。4.根据权利要求3所述的芸苔属植物的后代，其中后代包含SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14。5.人工DNA分子，其包含选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的序列。6.在包含DNA的样品中检测与芸苔属事件LBFLFK相对应的DNA存在的方法，所述方法包括步骤：(a)使样品与LBFLFK基因座1引物对和LBFLFK基因座2引物对接触，其中所述引物对在具有来自芸苔属事件LBFLFK的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生诊断芸苔属事件LBFLFK的基因座1扩增子和基因座2扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生基因座1扩增子和基因座2扩增子；和(c)检测扩增子，其中一个扩增子包含LBFLFK基因座1接头区域SEQIDNO:4或SEQIDNO:5或其互补序列，一个扩增子包含LBFLFK基因座2接头区域SEQIDNO:13或SEQIDNO:14或其互补序列。7.根据权利要求6所述的方法，其中：(a)LBFLFK基因座1引物对包含：(i)第一引物，其选自SEQIDNO:6的至少11个连续核苷酸、SEQIDNO:6的互补序列的至少11个连续核苷酸、SEQIDNO:7的至少11个连续核苷酸和SEQIDNO:7的互补序列的至少11个连续核苷酸；和(ii)第二引物，其选自SEQIDNO:3的至少11个连续核苷酸和SEQIDNO:3的互补序列的至少11个连续核苷酸，和(b)LBFLFK基因座2引物对包含：(i)第三引物，其选自SEQIDNO:15的至少11个连续核苷酸、SEQIDNO:15的互补序列的至少11个连续核苷酸、SEQIDNO:16的至少11个连续核苷酸和SEQIDNO:16的互补序列的至少11个连续核苷酸；和(ii)第四引物，其选自SEQIDNO:12的至少11个连续核苷酸和SEQIDNO:12的互补序列的至少11个连续核苷酸。8.根据权利要求7所述的方法，其中第一引物包含SEQIDNO:8，第二引物包含SEQIDNO:9，第三引物包含SEQIDNO:17，并且第四引物包含SEQIDNO:18。9.根据权利要求6所述的方法，还包括步骤：d)使样品与LBFLFK基因座1野生型引物对和LBFLFK基因座2野生型引物对接触，其中所述LBFLFK基因座1野生型引物对包含LBFLFK基因座1转基因插入的芸苔属基因组区域的至少11个连续核苷酸，所述LBFLFK基因座2野生型引物对包含LBFLFK基因座2转基因插入的芸苔属基因组区域的至少11个连续核苷酸；e)进行核酸扩增反应，由此产生与LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2插入相对应的同源野生型芸苔属基因组区域的扩增子；f)检测该野生型芸苔属扩增子；g)比较步骤c)中产生的扩增子与步骤f)中产生的扩增子，其中两种扩增子的存在表明，就LBFLFK基因座1和基因座2转基因插入而言，样品是杂合的。10.用于检测生物样品中芸苔属事件LBFLFK的试剂盒，其中试剂盒利用包括以下步骤的方法：(a)使样品与LBFLFK基因座1特异性DNA引物对和LBFLFK基因座2特异性DNA引物对接触；(b)进行核酸扩增反应，由此产生两种扩增子；和(c)检测扩增子，其中LBFLFK基因座1扩增子包含SEQIDNO:4或SEQIDNO:5，并且LBFLFK基因座2扩增子包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:14。11.油或粕，其衍生自芸苔属事件LBFLFK种子或其后代。12.根据权利要求11所述的油或粕，其中油或粕包含可检测量的诊断芸苔属事件LBFLFK的核苷酸序列，其中所述序列选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14。13.包含可检测量的芸苔属事件LBFLFKDNA序列的商业产品，其中所述序列选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14。14.用于产生包含改变的VLC-PUFA含量的芸苔属植物的方法，所述方法包括步骤：将包含芸苔属事件LBFLFK的植物与缺少事件LBFLFK的芸苔属植物杂交以获得包含芸苔属事件LBFLFK和改变的VLC-PUFA含量的植物，其中事件LBFLFK的样品已经以ATCC保藏号PTA-121703保藏。15.用于产生包含芸苔属事件LBFLFK的芸苔属品种的方法，包括步骤：将包含芸苔属事件LBFLFK的植物与第二芸苔属植...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·森杰，L·马蒂，I·孔策，J·鲍尔，D·雷恩，C·安德烈，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE