Pru p 3蛋白在制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了Pru p 3蛋白用于制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒的新的应用。本发明专利技术提供的采用Pru p 3蛋白制备的试剂盒，联合BAT用于预测桃过敏反应严重程度，其预测效果优于目前临床最常用的体外检测方法即桃及其组分sIgE检测。

【技术实现步骤摘要】
Prup3蛋白在制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒中的应用
本专利技术涉及检测试剂制备领域，具体涉及Prup3蛋白在制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒中的应用。
技术介绍
桃过敏是我国常见的食物过敏形式。桃过敏患者进食或接触桃后，可出现接触部位如唇、舌和咽等部位黏膜肿胀、瘙痒，即口腔黏膜变态反应综合征(oralallergysyndrom,OAS)，甚至更严重的全身反应(systemicreaction，SR)而危及生命。目前食物过敏尚无根治方法，主要防治措施是避免接触食物过敏原，当发生严重过敏反应时需使用肾上腺素进行急救。在日常生活中，做到完全避免接触过敏原有时很困难。因此，临床上迫切需要客观的检测指标帮助医生对食物过敏患者发生过敏反应的严重程度进行评估，识别潜在的可能发生严重过敏反应的患者，从而为其开具肾上腺素等急救药物提供客观依据。但迄今为主，临床尚缺乏一种可用来预测食物过敏反应严重程度的检测指标。目前，临床上诊断食物过敏主要基于进食敏感食物后发生急性过敏反应的病史和皮肤试验/血清特异性IgE(specificIgE,sIgE)检测。皮肤试验，因受操作者技术和所用试剂影响，特异性和敏感性受限，且存在发生过敏反应的风险，使其在临床应用中大大受限。血清sIgE检测操作简便、安全，已广泛应用于临床，包括放射性变应原吸附试验、酶联免疫吸附试验和CAP变应原检测系统(CAPsystem)，其中CAPsystem是目前公认的检测血清sIgE抗体的金标准。但是，该方法检测的sIgE是血清中游离的抗体，只有当此抗体与嗜碱性粒细胞和(或)肥大细胞结合，同时遇到过敏原形成“抗原桥”才能发挥生物学效应。因此，sIgE阳性只能反映机体处于致敏状态，并不能有效评估过敏反应发生的严重程度。近年来，组分检测在食物过敏中的应用越来越受到关注。由于它使用纯的引起致敏的变应原蛋白，因此提高了过敏原检测的特异性。在国外，花生过敏发病率较高，研究发现Arah2是花生主要致敏蛋白，对该组分致敏提示其进食花生易发生过敏症状。虽然组分检测在花生过敏诊断中非常有价值，但其在评估花生过敏反应严重程度中的作用有限。嗜碱性粒细胞和肥大细胞是参与I型超敏反应的重要效应细胞，其中，嗜碱性粒细胞尤其与食物诱发的严重过敏反应关系密切。近年来，人们利用流式细胞术(flowcytometry,FCM)来检测嗜碱性粒细胞膜表面活化标志物的变化，即嗜碱性粒细胞活化试验(basophilactivationtest,BAT)，目前尚无关于BAT在预测桃过敏反应严重程度中的研究报道。目前BAT临床研究中常用的两个特异性标志物是CD63和CD203c。其中，CD63又称为溶酶体相关膜糖蛋白3(LAMP-3)，是一个四跨膜超家族蛋白(transmembrane4superfamily，TM4SF)，可表达于多种细胞表面，如单核细胞、血小板和嗜碱性粒细胞。当嗜碱性粒细胞处于静息状态时，CD63只表达于胞内颗粒中，很少表达于膜表面；而在激活状态时，嗜碱性粒细胞脱颗粒发生易位，CD63与细胞膜融合并高表达于细胞膜表面，成为活化的嗜碱性粒细胞的特异性标志物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供Prup3蛋白用于制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒中的应用，制备的试剂盒可用于预测桃过敏反应的严重程度。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案：Prup3蛋白用于制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒。一种用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，包括桃致敏蛋白Prup3蛋白。如上所述的预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，所述Prup3蛋白的工作浓度为10～50ng/ml，其缓冲液为PBS。如上所述的桃过敏反应严重程度检测试剂盒，还包括刺激缓冲液、刺激质控、抗CD63-FITC和抗CCR3-PE的预混试剂、红细胞裂解液。如上所述的桃过敏反应严重程度检测试剂盒，优选地，所述刺激缓冲液中含白介素-3，所述白介素-3的工作浓度为3～6ng/ml，所述缓冲液为PBS缓冲液；所述刺激质控中含工作浓度为0.5～12.5ug/ml抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体，作为阳性对照；所述抗CD63-FITC和抗CCR3-PE的预混试剂中抗CD63-FITC的浓度为0.1～1.0mg/ml，所述抗CCR3-PE的浓度为5～30μg/ml；所述红细胞裂解液中含NH4CL100～150mmol/L，Tris10～30mmol/L，pH7.0～7.4。如上所述的桃过敏反应严重程度检测试剂盒，优选地，所述Prup3蛋白的工作浓度为25ng/ml，所述白介素-3的工作浓度为4.5ng/ml；所述刺激质控中含工作浓度为2.5μg/ml的抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体；所述抗CD63-FITC的浓度为0.5mg/ml，所述抗CCR3-PE的浓度为10μg/ml；所述NH4CL为139.6mmol/L，所述Tris为16.96mmol/L，pH7.2。本专利技术的有益效果在于：本专利技术中采用Prup3蛋白制备的试剂盒，联合BAT用于预测桃过敏反应严重程度，其预测效果优于目前临床最常用的体外检测方法即桃及其组分sIgE检测。附图说明图1为实施例2中FCS/SSC直方图上细胞分群。图2为选择嗜碱性粒细胞CCR3pos/SSClow。图3为实施例2中以Prup3作为刺激物时OAS组(局部过敏组)嗜碱性粒细胞活化的结果。图4为实施例2中以Prup3作为刺激物时SR组(全身过敏组)嗜碱性粒细胞活化的结果。具体实施方式本专利技术目的是寻找评估桃过敏反应严重程度的体外检测指标及检测试剂。本专利技术的专利技术人在前期研究中发现Prup3蛋白是我国桃过敏的主要致敏蛋白。进一步地，经本专利技术研究证实，Prup3蛋白联合BAT可以预测桃过敏反应的严重程度。对桃有严重过敏反应的患者嗜碱性粒细胞受到桃主要致敏蛋白Prup3刺激后，其嗜碱性粒细胞活化比例将明显增加，释放大量血管活性介质，这也是导致严重过敏症状发生的原因。本专利技术通过采用桃主要致敏蛋白Prup3刺激嗜碱性粒细胞，通过检测嗜碱性粒细胞表面CD63表达水平，计算CD63阳性的嗜碱性粒细胞的百分比即嗜碱性粒细胞活化率，作为评估过敏反应严重程度的指标。以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的前提下，对本专利技术所作的修饰或者替换，均属于本专利技术的范畴。实施例1Prup3蛋白联合BAT预测桃过敏反应严重程度的方法：采集受试者的肝素抗凝血，取50ul患者全血样本依次加入100ul刺激缓冲液、50ul相应的刺激物，混匀后，加入20ul荧光抗体试剂(抗CD63-FITC和抗CCR3-PE预混试剂)，轻柔混合，37℃水浴孵育15分钟。后加入2ml预热(18-28℃)的红细胞裂解液，轻柔混合，在18-28℃条件下避光孵育5-10分钟。离心力300g，离心5分钟，丢弃上清，重悬细胞，流式细胞仪上机检测。收集50000-100000个白细胞，在前向角散射(FCS)/侧向角散射(SSC)直方图上白细胞分成三群(淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)，在侧向角散射低值(SSClow)区域找到全部嗜碱性粒细胞CCR3pos群，收集嗜碱性粒细胞数量>300个。计算CD63阳性细胞在获得的嗜碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
Pru p 3蛋白用于制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒。

【技术特征摘要】
1.Prup3蛋白用于制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒。2.一种用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，其特征在于，其包括Prup3蛋白。3.如权利要求2所述的用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，其特征在于，所述Prup3蛋白的工作浓度为10～50ng/ml，其缓冲液为PBS。4.如权利要求2所述的用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，其特征在于，还包括刺激缓冲液、刺激质控、抗CD63-FITC和抗CCR3-PE的预混试剂、红细胞裂解液。5.如权利要求4所述的用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，其特征在于，所述刺激缓冲液中含工作浓度为3～6ng/ml白介素-3；所述刺激质控中含工作浓度为0.5～12.5μg/ml抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体，作为阳性对照；所述抗C...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹佳，邓珊，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：北京,11