本发明专利技术公开了一种人心肌肌钙蛋白I的双抗夹心ELISA检测试剂盒，以单克隆抗体7D2为捕获抗体，单克隆抗体7H4为检测抗体，其中，分泌单克隆抗体7D2的杂交瘤细胞株7D2于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：C2017120；分泌单克隆抗体7H4的杂交瘤细胞株7H4于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：C2017121。检测试剂盒灵敏度高，成本低，为人心肌肌钙蛋白I的检测提供了快速高效的分析手段。
【技术实现步骤摘要】
人心肌肌钙蛋白I的双抗夹心ELISA检测试剂盒
本专利技术涉及免疫检测领域，更具体地，涉及人心肌肌钙蛋白I的ELISA检测试剂盒。
技术介绍
心肌肌钙蛋白是调控心脏收缩的关键蛋白。由心肌肌钙蛋白I（cTnI）、心肌肌钙蛋白C（cTnC）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）三个亚基组成的三聚体复合物。cTnI是肌动蛋白的抑制亚基，通过抑制肌动蛋白的三磷酸腺苷（ATPase）的活性来调控肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用。cTnI的分子量约为24kDa，由209个氨基酸组成，是一种富含α螺旋的蛋白，理论等电点为9.87。TnI（肌钙蛋白I）存在三种亚型：骨骼肌肌钙蛋白I（sTnI）中存在快骨骼肌型和慢骨骼肌型，它们具有相似的分子量（20KD），但二者之间的氨基酸序列约存在40%的差异；第三种为心肌型。心肌肌钙蛋白I（cTnI）与骨骼肌型的氨基酸序列也存在40%的差异，cTnI末端比sTnI末端多31个氨基酸，并且cTnI在心肌细胞中只存在一种亚型，决定了cTnI在心肌细胞中的特异性。cTnI分子的第22位和第23位是丝氨酸。这两个氨基酸都可以在体内被蛋白激酶A磷酸化，因而在体内cTnI存在四种不同磷酸化类型。急性心肌梗塞（Acutemyocardialinfarction,AMI）是最常见的心血管疾病之一，是在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉的血流急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血所导致的冠状动脉病变，最终引起心肌的缺血性坏死。病情严重时，心脏无法再行使其泵血的功能，会导致病人突然死亡。因此，急性心肌梗塞的早期诊断对于其预防和治疗是非常重要的。cTnI被研究者认为是AMI诊断最好的生物指标之一，由于其在心肌受损时才在血液中出现，并且出现时间早，持续时间久，特异性强，因此国际临床化学联盟（IFCC）、美国临床生化学会（NACB）和中华医学检验分会等权威机构已经将cTnI作为AMI诊断的“金标准”。在心肌梗塞标志物中，cTnI被认为是比其他标志物更灵敏，特异性更高的“金标”。当心肌细胞的细胞膜完整时，cTnI是不能够透过细胞膜进入到血液中的。只有当心肌细胞受损时，cTnI迅速从心肌细胞释放到血液中，2-8小时内开始升高，在1-2天内达到顶峰，并且在3-8天后仍然能测到cTnI的量在升高，理论上cTnI在血清中维持的时间超过10天，较久的诊断窗口期对于心肌梗塞的诊断是非常重要的。研究证明，正常人和心肌梗塞患者血清中cTnI的临界值是50pg/mL，发病时血中浓度可达100～300μg/L。在血液中大部分的cTnI是以cTnI-T-C或者cTnI-C复合物的形式存在。在研究中发现cTnI开始是以单体的形式释放到血液中，但是随着心肌损伤程度增加，为了防止cTnI被降解，cTnI会以复合物的形式存在，接着由于各种因素的影响，复合物又分解成单体，所以用于检测cTnI的抗体应该能以同样的效率识别血液中各种复合形式的cTnI，而现有技术中严重缺乏这样的单克隆抗体资源。
技术实现思路
本专利技术为克服上述现有技术所述的至少一种缺陷，提供一种心肌肌钙蛋白I的ELISA检测试剂盒。本专利技术的一个目的是提供一种人心肌肌钙蛋白I的双抗夹心ELISA检测试剂盒。一种人心肌肌钙蛋白I的双抗夹心ELISA检测试剂盒，以单克隆抗体7D2为捕获抗体，单克隆抗体7H4为检测抗体，其中，分泌单克隆抗体7D2的杂交瘤细胞株7D2于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：C2017120；分泌单克隆抗体7H4的杂交瘤细胞株7H4于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：C2017121。优选地，该试剂盒还包括，阴性对照，阳性对照，终止液，显色液，酶联板，包被液，PBS-T缓冲液，PBS。优选地，检测抗体7H4被辣根过氧化物酶标记。优选地，显色液为TMB。优选地，终止液为10%H2SO4。优选地，包被液为0.05M，pH9.6的碳酸盐包被缓冲液。优选地，阳性对照为cTnI蛋白。单克隆抗体7H4是利用免疫全蛋白cTnI-T-C所制备的单克隆抗体，具体制备方法如下：用全蛋白cTnI-T-C免疫Balb/c小鼠，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞株，经过三次有限稀释克隆技术获得能够分泌稳定抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水型单抗，纯化后得到单克隆抗体。单克隆抗体7D2是利用cTnI上的13-24位氨基酸表位，偶联载体蛋白BSA，形成的完全抗原免疫小鼠所制备的单克隆抗体，具体制备方法如下：合成cTnI上的13-24位氨基酸表位，偶联载体蛋白BSA，形成完全抗原，免疫Balb/c小鼠，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞株，经过三次有限稀释克隆技术获得能够分泌稳定抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水型单抗，纯化后得到单克隆抗体。用包被缓冲液稀释7D2至2μg/mL，每孔加100μL，4℃过夜。5%脱脂奶粉封闭一小时。每孔加入50μL待测样品，37℃孵育1小时。分别加入100μL按照1:2000稀释的HRP-7H4，孵育一小时。加入100μL显色液TMB，显色10分钟，加入50μL终止液。酶标仪读取450nm吸光度数值OD450，分析数据。双抗夹心ELISA法具有直观性强、检测灵敏度高等优点，常用于检测带有多个抗原表位的大分子抗原，如大分子蛋白质、病毒、致病菌等。本专利技术用理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，成本低，为人心肌肌钙蛋白I的检测提供了快速高效的分析手段。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体7D2、7H4均为是高亲和力、高特异性的cTnI鼠源性单克隆抗体，能够结合游离的cTnI、二聚体复合物cTnI-C、三聚体复合物cTnI-T-C三种形式的cTnI，因此可以用于检测血清中cTnI含量，为开发快速检测心肌梗塞试剂盒奠定基础。附图说明图1为抗体7D2轻重链可变区的3个CDR（互补决定簇）区。图2为抗体7H4轻重链可变区的3个CDR（互补决定簇）区。图3为抗体7D2和7H4纯化后的SDS-PAGE检测图，其中，1为蛋白Marker，2为7D2，3为7H4。图4为抗体7D2和7H4的效价检测ELISA结果图，其中，图A为7D2，图B为7H4。图5为抗体7D2和7H4的亲和力常数检测ELISA图，其中，图A为7D2，图B为7H4。图6为抗体7D2和7H4的与cTnI和cTnI-C反应图，其中，其中，图A为cTnI单体，图B为cTnI-C复合物。图7为7D2/HRP-7H4和7H4/HRP-7D2的检测曲线。图8为7D2/HRP-7H4检测标准曲线图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体的制备，包括如下步骤：一、抗原单克隆抗体7D2是通过用cTnI上13-24位氨基酸与BSA偶联本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人心肌肌钙蛋白I的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，以单克隆抗体7D2为捕获抗体，单克隆抗体7H4为检测抗体，其中，分泌单克隆抗体7D2的杂交瘤细胞株7D2于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：C2017120；分泌单克隆抗体7H4的杂交瘤细胞株7H4于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：C2017121。
【技术特征摘要】
1.一种人心肌肌钙蛋白I的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，以单克隆抗体7D2为捕获抗体，单克隆抗体7H4为检测抗体，其中，分泌单克隆抗体7D2的杂交瘤细胞株7D2于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：C2017120；分泌单克隆抗体7H4的杂交瘤细胞株7H4于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：C2017121。2.根据权利要求1所述的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括，阴性对照，阳性对照，终...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宏，余娟，李文丽，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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