象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系制造技术

本发明专利技术属于生物信息学分析技术领域，公开了一种象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系，为38000多个Unigenes序列，利用生物信息学分析，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。本发明专利技术利用原核表达技术，获得ME‑MAPK1、ME‑COL1和MeHsp70重组蛋白，为蛋白特性分析奠定基础；成功构建M.enterolobii离体RNAi浸泡体系和烟草脆裂病毒TRV载体为介导的VIGSRNAi活体沉默体系，诱导Me‑mapk1、Me‑crt1和Me‑cbp1基因下调表达；为M.enterolobii防治，奠定了必要的分子基础。

Elephant ear root transcriptome database, fusion protein, immersion system, silencing system

The invention belongs to the technical field of biological information, discloses an elephant ear root transcriptome database, fusion protein, immersion system, silencing system, more than 38000 Unigenes sequences by bioinformatics analysis, predict more than 230 Meloidogyne enterolobii potential target candidate gene RNAi. Prokaryotic expression by using the technique of the invention, ME MAPK1, ME COL1 and MeHsp70 recombinant protein, and lay the foundation for the successful construction of M.enterolobii protein analysis; in vitro RNAi immersion system and tobacco rattle virus TRV vector for in vivo VIGSRNAi silencing system mediated by Me induced by mapk1, Me, CRT1 and Me CBP1 expression of M.enterolobii gene; prevention, lay the necessary molecular basis.

【技术实现步骤摘要】
象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系
本专利技术属于生物信息学分析
，尤其涉及一种象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系。
技术介绍
象耳豆根结线虫(Meloidogyneenterolobii)最早在1983年由杨宝君等在海南儋州的象耳豆树上发现并定名。徐建华等人证明国外学者广泛报道的玛雅根结线虫(M.mayaguensis)为M.enterolobii的异名。该线虫在美洲、非洲、欧洲等均有分布，为世界上公认的危害最大的根结线虫之一。2008年，欧洲首次报道M.enterolobii，同年，EPPO报道中国出口欧洲的玫瑰花上截获到该线虫，EPPO对该线虫进行风险评估，认为对中欧地区作物存在较大威胁。目前，已报道发现该线虫的国家有巴西、越南、中国、古巴、法国、危地马拉、波多黎各、马提尼克、马拉维、塞内加尔、特立尼达拉岛和多巴哥岛、南非、美国、西非、等等国家和地区。EPPO发布有害生物预警，因此估计该种在欧洲温暖地区和温室中可存活。而在来自中国的玫瑰活体植株上也截获到M.enterolobii，表明其在略冷的温度下也可存活。在国内，M.enterolobii近年陆续被报道，目前已遍布海南全岛，广东省也有发现。据调查，在海南岛主要栽培作物葫芦科蔬菜、茄果类蔬菜、南药作物、热带果树等都已经有M.enterolobii的广泛寄生，正逐渐代替南方根结线虫(M.incognita)，成为中国热带亚热带地区最重要的一种根结线虫。与模式线虫秀丽杆线虫(Caenorhabditiselegans)、其它植物寄生线虫北方根结线虫(M.hapla)和南方根结线虫(M.incognita)相比，M.enterolobii功能基因组的研究进展相当缓慢，至今尚未获得其完整的基因组信息。而M.incognita和M.hapla的基因组信息分别于2008年8月和10月公布，这为开发新的针对根结线虫的药物靶标提供了宝贵的基因资源。同时，有研究证实，一些基因在秀丽杆线虫或南方根结线虫中具有RNAi胚致死或不育突变效应。特别是Gunsalus等建立的秀丽杆线虫大规模RNAi分析表型与基因序列相关性网络平台RNAiDB，为开展植物线虫与秀丽杆线虫RNAi相关比较功能基因组生物信息研究提供了分析工具，也使开展象耳豆根结线虫研究对这些已获得的线虫基因组生物信息资源得以充分利用。试验证明植物寄生线虫与秀丽杆线虫具有相同的RNAi作用，可直接进行其功能基因组学研究。并且，根结线虫与孢囊线虫一样同属栖居型内寄生线虫，在孢囊线虫上所建立的RNAi技术，同样适应根结线虫功能基因的鉴定。Bakhetia等利用RNAi研究了M.incognita过氧化酶和NADPH氧化酶基因的功能，实验表明M.incognita中90-95％的个体吸收了编码过氧化物酶的dsRNA，14d后雌虫的数量和大小受到明显抑制，产卵量减少了70％以上。另外，Fanelli等将花生根结线虫的卵浸泡在dsRNA混合液中，将dsRNA导入线虫卵内，成功的抑制了线虫几丁质酶的合成。目前，基于模式线虫秀丽杆线虫RNAi比较功能基因组信息和南方根结线虫、北方根结线虫基因组信息分析，大量与致死效应相关的基因被克隆，并被进行RNAi分析。而M.enterolobii由于不清楚其基因组信息，只能通过同源克隆得到少数几个RNAi表型基因。卓侃等(2011)通过同源克隆首次克隆了M.enterolobii果胶酸裂解酶基因(ME-PEL-1)，该基因与南方根结线虫的果胶酸裂解酶MI-PEL-1和爪哇根结线虫的果胶酸裂解酶MJ-PEL-1相似性最高，且系统进化树显示ME-PEL-1也与它们最为接近。利用RNAi技术对M.enterolobii2龄幼虫Me-pel-1进行沉默,结果发现Me-pel-1基因被干扰后，M.enterolobii2龄幼虫对番茄的侵染率显著降低。表明Me-pel-1基因在象耳豆根结线虫侵染寄主的过程中发挥重要作用。练冬梅等(2015)同样通过同源克隆，克隆和表达了M.enterolobii热激蛋白Hsp70基因，发现该基因与M.enterolobii生态适应性机理有关。转录组测序和后续的生物信息学分析以及试验验证是一个挖掘功能基因的重要途径，是基因功能及结构研究的基础和出发点。转录组学相对于基因组学而言，只研究被转录的基因，研究范围缩小，针对性更强。因而，结合转录组数据库、转录组测序、生物信息学预测和后续试验验证，可以得到大量M.enterolobii的RNAi功能基因。为M.enterolobii防治，开辟新的途径。综上所述，现有技术存在的问题是：象耳豆根结线虫(M.enterolobii)近年来陆续被报道，目前已遍布海南全岛，正逐渐代替南方根结线虫，成为中国热带亚热带地区最重要的一种根结线虫。与模式线虫秀丽杆线虫(Caenorhabditiselegans)、其它植物寄生线虫北方根结线虫(M.hapla)和南方根结线虫(M.incognita)相比，M.enterolobii功能基因组的研究进展相当缓慢，M.incognita和M.hapla基因组信息分别于2008年8月和10月公布，而M.enterolobii基因组信息至今尚未公布。同时，研究证实，一些基因在秀丽杆线虫或南方根结线虫中具有RNAi胚致死或不育突变效应。基于模式线虫秀丽杆线虫RNAi比较功能基因组信息和南方根结线虫、北方根结线虫基因组信息分析，大量与致死效应相关的基因被克隆，并被进行RNAi分析。而M.enterolobii由于不清楚其基因组信息，只能通过同源克隆得到少数几个RNAi表型基因(ME-PEL-1、Hsp70等)。因而，结合转录组数据库、转录组测序、生物信息学预测和后续试验验证，可以得到大量M.enterolobii的RNAi功能基因。转录组测序技术主要是针对转录产物mRNA进行高通量测序，无需了解物种基因组信息，能够对任意物种进行转录组分析，只研究被转录的基因，研究范围缩小，针对性更强。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系。本专利技术是这样实现的，一种象耳豆根转录组数据库，所述象耳豆根转录组数据库为38000多个Unigenes序列，利用生物信息学分析，预测出包括促分裂原活化蛋白激酶Me-mapk1、胶原蛋白Me-col1、热激蛋白Hsp70、钙网蛋白Me-crt、纤维素结合蛋白Me-cbp-1、果胶酸裂解酶Me-pel2等在内的230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。本专利技术的另一目的在于提供一种所述象耳豆根转录组数据库的构建方法，所述象耳豆根转录组数据库的构建方法包括：步骤一，完成M.enterolobii的J2转录组测序，获得8.88GbCleanData，Q30碱基百分比为89.55％；Denovo组装后共获得38,221条Unigene；其中长度在1kb以上的Unigene有8,074条；步骤二，对Unigene进行功能注释，包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对，共获得18,243条Unigene的注释结果。完成基于Unigene本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种象耳豆根转录组数据库，其特征在于，所述象耳豆根转录组数据库为38000多个Unigenes序列，利用生物信息学分析，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。

【技术特征摘要】
1.一种象耳豆根转录组数据库，其特征在于，所述象耳豆根转录组数据库为38000多个Unigenes序列，利用生物信息学分析，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。2.一种如权利要求1所述象耳豆根转录组数据库的构建方法，其特征在于，所述象耳豆根转录组数据库的构建方法包括：步骤一，完成M.enterolobii的J2转录组测序，获得8.88GbCleanData，Q30碱基百分比为89.55％；Denovo组装后共获得38,221条Unigene；其中长度在1kb以上的Unigene有8,074条；步骤二，对Unigene进行功能注释，包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对，共获得18,243条Unigene的注释结果；完成基于Unigene库的基因结构分析，其中SSR分析共获得1,927个SSR标记；同时还进行了CDS预测分析；完成基因在样品中的表达量分析；步骤三，与模式秀丽小杆线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵志祥，龙海波，严婉荣，肖敏，陈绵才，曾向萍，
申请(专利权)人：海南省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46