可控载体消除方法及易用型CRISPR‑Cas9工具技术

本发明专利技术公开了一种可控载体消除方法及易用型CRISPR‑Cas9工具。本发明专利技术提供了可控载体消除工具，由控制模块(包括：含有严谨调控型启动子和归巢核酸内切酶编码基因的核心区域，分别位于核心区域两端的终止子，及分别位于两终止子外端的归巢核酸内切酶识别序列)和消除模块(包括：抗生素抗性基因表达盒，及位于两端的归巢核酸内切酶识别序列)组成。本发明专利技术可简单、快速及高效的一步去除质粒载体，进一步开发的易用型CRISPR‑Cas9系统可实现Cas9和sgRNA编码质粒一步从宿主细胞中快速消除。该易用型CRISPR‑Cas9系统非常方便、实用，极大节约实验时间，减少实验强度，是非常实用的基因编辑工具。

【技术实现步骤摘要】
可控载体消除方法及易用型CRISPR-Cas9工具
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种可控的载体消除方法及易用型的CRISPR-Cas9基因编辑工具。
技术介绍
载体是重要的分子生物学操作平台，基因操作工具多是基于载体平台而开发的。这些基因操作工具，比如基因编辑类，大片段染色体整合类，以及实验进化类等，极大地方便了遗传操作。然而，如何快速在遗传改造完成之后，将其所在的载体从宿主细胞中消除，却是一个制约后续遗传改造或应用的难题。工具载体残留在宿主细胞中，会给细胞造成不必要的代谢负担，劫持细胞资源。而某些遗传操作工具，其功能元件对宿主细胞是有毒性的，更需要将其快速消除。同时，将工具载体从菌体细胞中消除，回收了工具载体所使用的复制元件和抗生素标记，便于以后针对该菌株的其他遗传操作。目前常用的载体消除方法，包括物理方法(如微波)，化学方法，利用反向筛选标记，以及利用温度敏感型的复制子等。其中，物理、化学的方法，效率较低，操作繁琐，需要较长的实验周期和大量的筛选工作，并不适合经常性需求的工具载体的消除。另一方面，物理、化学的方法往往具有一定的诱变性，增加了DNA突变的风险。而基于反筛选标记的载体消除方法，往往需要构建一个突变菌株，即将反筛选标记在基因组上的拷贝先敲除，并在载体上进行互补。比如Clostridiumcellulolyticum菌株，敲除了基因组上本身的pyfF基因(编码orotidine5-phosphatedecarboxylase)，并在工具载体上互补，实现了利用这一反筛选标记去除Clostridium中的ClosTron系统的目的[1]。但是使用这一方法的缺陷是将以后的操作都限制在该突变菌株内，无法在其他pyfF野生型的菌株内使用该系统。利用温度敏感型复制子的方法，虽然与物理、化学方法，以及基于反筛选标记的方法相比较要简单，但是温度敏感型复制子是菌株特异的，并不是每个菌株都开发出这样的温度敏感型复制子。同时，获得温度敏感的复制子，往往需要通过对初始载体的复制子区域进行突变，并通过大量筛选来获得温度敏感的表型，这一过程极其繁琐。并且，突变获得的复制子，其某些基础性状有变化，比如质粒稳定性，拷贝数等[2]。因此，通过突变获得的温敏复制子，需要对载体性质进行重新表征。成簇间隔短回文重复序列技术(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)是重要的基因编辑技术[3]。该系统由成簇间隔的短回文重复序列和Cas基因形成，CRISPR-Cas复合体与靶向序列互补配对，引导核酸内切酶Cas对靶向序列进行双链DNA切割。II型Cas9蛋白也是基因编辑中使用最多的一种，其可以定向于几乎全部染色体位置，唯一需要的因素是Protospacer-adjacentmotif(PAM)序列。在嗜热链球菌中，PAM序列多为NGG，用于靶向DNA序列的定位。切割的过程需要另外两个RNA的引导，分别是CRISPRRNA(crRNA)和反式CRISPRRNA(trans-activatingCRISPRRNA,tracrRNA)。也可以将这两个RNA合并成一个向导RNA(single-guideRNA,sgRNA)，这样就只需要表达单个sgRNA就可以介导Cas9实现靶向位点的切割的目的，这一设计使得定位靶向序列比同时分别表达crRNA和tracrRNA更加方便。在细菌中应用CRISPR-Cas9高效基因编辑，最早是ZhangFeng课题组在大肠杆菌和肺炎链球菌中实现的[4]。2015年，Jakociunas等利用CRISPR-Cas9技术在酿酒酵母中实现了多元代谢途径工程改造[5]。Jan-PetervanPijkeren课题组在2014年在乳酸菌Lactobacillusreuteri中实现了染色体编辑[6]。在所有细菌中，大肠杆菌中开发的CRISPR-Cas9系统版本最多[7-11]。然而，如何在基因编辑完成之后，将CRISPR-Cas9系统快速消除却是一个亟待解决的问题。合成生物学工作者Jan-PeterVanPijkeren在Lactobacillusreuteri中发现，其构建的CRISPR-Cas9系统在大约70代传代后，大约30％的细胞中CRISPR-Cas9系统所在的载体可以被消除，他特别指出CRISPR载体的去除需要进一步提高效率。而许多其他细菌开发的CRISPR-Cas9系统并没有给出载体消除的解决方案。在模式菌株大肠杆菌中，已经有科学工作者注意到这一问题，并给出了基于温度敏感型的复制子的解决方案。Jiang等在其为大肠杆菌构建的CRISPR-Cas9系统中设计了载体消除的办法，以期实现对基因编辑的重复操作[8]。具体的策略是，在温度敏感型复制子pSC101的基础上构建Cas9表达载体，其上同时有用PTrc启动子控制表达的sgRNA-pMB1，这段sgRNA靶向于pTarget载体(sgRNA表达载体)的复制起点。通过IPTG诱导sgRNA-pMB1表达，就可以引导Cas9切割sgRNA表达的pTarget载体的复制起始位点，从而将其消除；再通过改变培养温度将Cas9所在的载体消除掉。然而这种策略是逐步的，实验的工作量和时间较大。Reisch等也开发出了另一套基于温度敏感型复制子pSC101的CRISPR-Cas9系统[12]。该系统中，将sgRNA置于温度敏感型复制子pSC101所在的载体上。在基因编辑完成之后，转入一个靶向Cas9蛋白所在的载体的sgRNA表达载体，将Cas9蛋白所在载体消除掉，再通过改变培养温度，将sgRNA载体消除掉。以上所述的CRISPR-Cas9系统都是需要逐步进行消除操作的。因此，开发一种可以快速使质粒载体一步消除的方法是非常必要的，将这种方法应用于CRISPR-Cas9系统将有助于其快速高效的消除。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可控载体消除方法及易用型CRISPR-Cas9工具。本专利技术提供了可控的载体消除工具，其具有控制模块和消除模块。单独的控制模块也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所提供的易用型CRISPR-Cas9基因编辑工具，较传统的CRISPR-Cas9系统更容易从宿主细胞中消除，便于快速基因改造。本专利技术首先提供了一种DNA片段A(即控制模块)，包括如下结构：含有严谨调控型启动子和由所述严谨调控型启动子控制表达的归巢核酸内切酶的编码基因的核心区域，分别位于所述核心区域两端的两个终止子，以及分别位于所述两个终止子外端的两个所述归巢核酸内切酶的识别序列。本专利技术还提供了一成套DNA片段，由DNA片段B(即消除模块)和上述DNA片段A(即控制模块)组成；所述DNA片段B包含有如下结构：抗生素抗性基因表达盒，以及位于所述抗生素抗性基因表达盒两端的所述归巢核酸内切酶的识别序列。在本专利技术的一个实施例中，所述归巢核酸内切酶具体为归巢核酸内切酶I-SceI。相应的，所述归巢核酸内切酶的识别序列为归巢核酸内切酶I-SceI的识别序列，具体为5′-TAGGGATAACAGGGTAAT-3′。在本专利技术的一个实施例中，在所述DNA片段A(即控制模块)中，所述严谨调控型启动子具体为PBad启动子，其所对应的调本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA片段A，包括如下结构：含有严谨调控型启动子和由所述严谨调控型启动子控制表达的归巢核酸内切酶的编码基因的核心区域，分别位于所述核心区域两端的两个终止子，以及分别位于所述两个终止子外端的两个所述归巢核酸内切酶的识别序列。

【技术特征摘要】
1.DNA片段A，包括如下结构：含有严谨调控型启动子和由所述严谨调控型启动子控制表达的归巢核酸内切酶的编码基因的核心区域，分别位于所述核心区域两端的两个终止子，以及分别位于所述两个终止子外端的两个所述归巢核酸内切酶的识别序列。2.成套DNA片段，由DNA片段B和权利要求1中的所述DNA片段A组成；所述DNA片段B包含有如下结构：抗生素抗性基因表达盒，以及位于所述抗生素抗性基因表达盒两端的所述归巢核酸内切酶的识别序列。3.根据权利要求1或2所述的DNA片段A或成套DNA片段，其特征在于：所述归巢核酸内切酶为归巢核酸内切酶I-SceI。4.根据权利要求1-3中任一所述的DNA片段A或成套DNA片段，其特征在于：在所述DNA片段A中，所述严谨调控型启动子为PBAD启动子。5.根据权利要求1-4中任一所述的DNA片段A或成套DNA片段，其特征在于：在所述DNA片段A中，所述两个终止子分别为TET终止子和T1T2终止子。6.含有权利要求1-5中任一所述的DNA片段A或成套DNA片段的重组载体或重组菌。7.权利要求1-5中任一所述的DNA片段A或成套DNA片段或权利要求6所述的重组载体或重组菌在可控消除外源工具载体中的应用。8.一种可控消除外源工具载体的方法，为如下(A)或(B)：(A)当待消除的外源工具载体为一个载体时，所述方法包括如下步骤：将权利要求1-5中任一所述的DNA片段A克隆到所述待消除的外源工具载体中，需要启动消除时，外源加入能够诱导所述严谨调控型启动子启动转录的诱导物；(B)当待消除的外源工具载体为多个载体时，所述方法包括如下步骤(B1)或(B2)：(B1)将权利要求1-5中任一所述的DNA片段A...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘双江，汤强，姜成英，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11