可控载体消除方法及易用型CRISPR‑Cas9工具技术

本发明专利技术公开了一种可控载体消除方法及易用型CRISPR‑Cas9工具。本发明专利技术提供了可控载体消除工具，由控制模块(包括：含有严谨调控型启动子和归巢核酸内切酶编码基因的核心区域，分别位于核心区域两端的终止子，及分别位于两终止子外端的归巢核酸内切酶识别序列)和消除模块(包括：抗生素抗性基因表达盒，及位于两端的归巢核酸内切酶识别序列)组成。本发明专利技术可简单、快速及高效的一步去除质粒载体，进一步开发的易用型CRISPR‑Cas9系统可实现Cas9和sgRNA编码质粒一步从宿主细胞中快速消除。该易用型CRISPR‑Cas9系统非常方便、实用，极大节约实验时间，减少实验强度，是非常实用的基因编辑工具。

【技术实现步骤摘要】
可控载体消除方法及易用型CRISPR-Cas9工具
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种可控的载体消除方法及易用型的CRISPR-Cas9基因编辑工具。
技术介绍
载体是重要的分子生物学操作平台，基因操作工具多是基于载体平台而开发的。这些基因操作工具，比如基因编辑类，大片段染色体整合类，以及实验进化类等，极大地方便了遗传操作。然而，如何快速在遗传改造完成之后，将其所在的载体从宿主细胞中消除，却是一个制约后续遗传改造或应用的难题。工具载体残留在宿主细胞中，会给细胞造成不必要的代谢负担，劫持细胞资源。而某些遗传操作工具，其功能元件对宿主细胞是有毒性的，更需要将其快速消除。同时，将工具载体从菌体细胞中消除，回收了工具载体所使用的复制元件和抗生素标记，便于以后针对该菌株的其他遗传操作。目前常用的载体消除方法，包括物理方法(如微波)，化学方法，利用反向筛选标记，以及利用温度敏感型的复制子等。其中，物理、化学的方法，效率较低，操作繁琐，需要较长的实验周期和大量的筛选工作，并不适合经常性需求的工具载体的消除。另一方面，物理、化学的方法往往具有一定的诱变性，增加了DNA突变的风险。而基于反筛选标记的本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA片段A，包括如下结构：含有严谨调控型启动子和由所述严谨调控型启动子控制表达的归巢核酸内切酶的编码基因的核心区域，分别位于所述核心区域两端的两个终止子，以及分别位于所述两个终止子外端的两个所述归巢核酸内切酶的识别序列。

【技术特征摘要】
1.DNA片段A，包括如下结构：含有严谨调控型启动子和由所述严谨调控型启动子控制表达的归巢核酸内切酶的编码基因的核心区域，分别位于所述核心区域两端的两个终止子，以及分别位于所述两个终止子外端的两个所述归巢核酸内切酶的识别序列。2.成套DNA片段，由DNA片段B和权利要求1中的所述DNA片段A组成；所述DNA片段B包含有如下结构：抗生素抗性基因表达盒，以及位于所述抗生素抗性基因表达盒两端的所述归巢核酸内切酶的识别序列。3.根据权利要求1或2所述的DNA片段A或成套DNA片段，其特征在于：所述归巢核酸内切酶为归巢核酸内切酶I-SceI。4.根据权利要求1-3中任一所述的DNA片段A或成套DNA片段，其特征在于：在所述DNA片段A中，所述严谨调控型启动子为PBAD启动子。5.根据权利要求1-4中任一所述的DNA片段A或成套DNA片段，其特征在于：在所述DNA片段A中，所述两个终止子分别为TET终止子和T1T2终止子。6.含有权利要求1-5中任一所述的DNA片段A或成套DNA片段的重组载体或重组菌。7.权利要求1-5中任一所述的DNA片段A或成套DNA片段或权利要求6所述的重组载体或重组菌在可控消除外源工具载体中的应用。8.一种可控消除外源工具载体的方法，为如下(A)或(B)：(A)当待消除的外源工具载体为一个载体时，所述方法包括如下步骤：将权利要求1-5中任一所述的DNA片段A克隆到所述待消除的外源工具载体中，需要启动消除时，外源加入能够诱导所述严谨调控型启动子启动转录的诱导物；(B)当待消除的外源工具载体为多个载体时，所述方法包括如下步骤(B1)或(B2)：(B1)将权利要求1-5中任一所述的DNA片段A...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘双江，汤强，姜成英，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11