一株荧光假单胞菌及其在防治核桃黑斑病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株荧光假单胞菌及其在防治核桃黑斑病中的应用。该菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株GH2‑1，保藏号为CGMCC No.14743。实验表明，本发明专利技术的荧光假单胞菌菌株具有生长速度快、抗逆性强，在核桃表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该荧光假单胞菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治核桃黑斑病害，还能有效促进核桃生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂。

【技术实现步骤摘要】
一株荧光假单胞菌及其在防治核桃黑斑病中的应用
本专利技术属于植物病害生物防治
具体而言，本专利技术涉及一株荧光假单胞菌及其在防治核桃黑斑病中的应用，以及采用该荧光假单胞菌制备的生物防治制剂。
技术介绍
核桃黑斑病[Xanthomonasjugandis(Pierce)Dowson]，又名核桃黑腐病，在欧美一些国家发病率较高。在我国，该病广泛分布于河北、山东、山西、辽宁、河南、江苏、浙江、四川、云南、山西、甘肃等省核桃产区。核桃黑斑病由核桃黄极毛杆菌[Xanthomonasjugandis(Pierce)Dowson]引起，主要危害叶片、嫩枝、幼果及花器，每年4月～8月发病。叶片感病后，在叶片上出现圆形及多角形小褐斑，严重时相连成片，病斑外围有水渍状晕圈；枝梢上病斑长形，黑褐色，稍凹陷，严重时因病斑扩展包围枝条而使上段枯死；花序受侵后，产生黑褐色水渍状病斑；幼果受害时，果面发生黑色小斑点，无明显边缘，逐渐扩大成片变黑，并深入果肉，使整个果实连同核仁全部变黑腐烂脱落。近年来由于我国核桃栽培面积的增大，核桃黑斑病病害问题也日渐突出，在花期降雨偏多的年份更为严重，该病导致落果严重，严重时落果率达60％以上，甚至绝收。目前防治核桃黑斑病主要以化学农药为主，但化学农药的高残留对环境的污染严重。大量农药挥发到空气中、流入水体中、沉降聚集在土壤中，污染农畜渔果产品，并通过食物链的富集作用转移到人体内，对人体产生危害，因而目前化学防治方法仍然不能行之有效地解决核桃细菌性黑斑病问题。生物防治是利用物种间的拮抗作用来减少病害的发生，对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性，因而具有化学杀菌剂不具有的优势，正逐步成为代替化学杀菌剂的最佳方式。而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)属革兰氏阴性杆状细菌，常见于植物根围和土壤中，是作为植物根际促生细菌中研究较多的一种细菌，由于其繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养、制剂稳定、施用方便、不污染环境、防治多种植物病害等优点，我国农业部已将其列为可注册登记的微生物农药和肥料品种之一，在全国范围内推广使用。由于其能产生一种或多种抗生素，所以对植物病害，尤其是土传病害如猝倒病、根腐病、枯萎病等均有很好的防治作用，是一类重要的有益微生物资源，在农业生产上具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株用于高效防治核桃黑斑病的新的微生物——荧光假单胞菌菌株GH2-1。本专利技术的荧光假单胞菌菌株具有生长速度快、抗逆性强，在核桃表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术所提供的菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株GH2-1，是从山东省青岛市莱西市莱西湖泥中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.14743。其具有以下生物学特性：在牛肉膏培养基上菌落微隆起，淡黄色，边缘呈波浪花纹向外扩展状，表面较湿润，易用接种针挑起，产生水溶性黄绿色色素，紫外光斜光照射下可见黄绿色荧光；镜检，菌体细胞呈杆状，具极生鞭毛，能运动；经革兰氏染色呈阴性(以大肠杆菌为对照)；不产芽孢和荚膜。本专利技术荧光假单胞菌(P.fluorescens)菌株GH2-1的培养方法或繁殖方法包括：(1)普通培养保存采用牛肉膏培养基，配方为：牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.4～7.6；(2)实验室液体培养采用牛肉膏液体培养基，配方为：牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.4～7.6；(3)固体培养基配方：固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.8∶1.2；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝55∶25∶17∶2；所述无机盐按质量百分比计为，20％磷酸二氢钾，5％硫酸镁，10％硫酸铵，65％轻质碳酸钙。(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方本专利技术还提供一种用于防治核桃黑斑病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的荧光假单胞菌(P.fluorescens)菌株GH2-1。并且，本专利技术还提供了一种用于防治核桃黑斑病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有黑斑病病的核桃植株施用上述荧光假单胞菌(P.fluorescens)菌株GH2-1或者上述生物防治制剂。本专利技术也提供了上述荧光假单胞菌菌株或者上述生物防治制剂在防治核桃黑斑病中的用途。本专利技术所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：(1)制备所述荧光假单胞菌菌株GH2-1的种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，25～27℃下恒温培养；(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温25～27℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：(1)将所述荧光假单胞菌菌株GH2-1移植到牛肉膏液体培养基，25～27℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，25～27℃下振荡培养3～5d；(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温25～27℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养5～6d。其中，步骤(1)中的牛肉膏液体培养基，配方为牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.4～7.6。步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.8∶1.2；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝55∶25∶17∶2；所述无机盐按质量百分比计为，20％磷酸二氢钾，5％硫酸镁，10％硫酸铵，65％轻质碳酸钙。步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。实验表明，本专利技术的荧光假单胞菌菌株具有生长速度快、抗逆性强，在核桃表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该荧光假单胞菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治核桃黑斑病害，还能有效促进核桃生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治核桃黑斑病。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本专利技术的保护范围内。实施例11、荧光假单胞菌(P.fluorescens)GH2-1的分离与纯化本专利技术的荧光假单胞菌(P.fluorescens)GH2-1是于2013年5月从山东省青岛市莱西市莱西湖湖泥中采用稀释平板法和平板划线法于分离获得的，分离方法为：(1)荧光假单胞菌的分离泥样的采集，在山东省莱西市采集莱西湖湖泥，混匀，带回室内暂存于4℃温箱中。本文档来自技高网...

【技术保护点】
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株GH2‑1，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.14743。

【技术特征摘要】
1.荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株GH2-1，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.14743。2.权利要求1所述的荧光假单胞菌菌株GH2-1在防治核桃黑斑病中的应用。3.一种包括权利要求1所述的荧光假单胞菌菌株GH2-1的生物防治制剂。4.权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：(1)制备荧光假单胞菌菌株GH2-1的种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，25～27℃下恒温培养；(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温25～27℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。5.如权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.8∶1.2；所述固料按质量比计为：稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝55∶25∶17∶2；所述无机盐按质量百分比计为：磷酸二...

【专利技术属性】
技术研发人员：段春华，李宗泰，牛赡光，张淑静，刘慇，王清海，曲永赟，
申请(专利权)人：山东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37