一种从绣球菌液体发酵菌丝体中提取生物活性β‑葡聚糖的方法技术

本发明专利技术涉及从绣球菌液体发酵菌丝体中提取生物活性β‑葡聚糖的方法，可有效解决高效、低成本、产量高、质量好生产β‑葡聚糖的问题，方法是，用培养基培养绣球菌菌丝体，收集绣球菌菌丝体，用蒸馏水洗去培养基，匀浆，然后置入高压细胞破碎仪中处理，得高压处理后的液体，离心，上清液加热，再离心，上清液中加入无水乙醇，沉淀，然后离心，弃上清液，用乙醇对沉淀漂洗2次，收集沉淀，沉淀冻干，得绣球菌β‑葡聚糖，本发明专利技术原料丰富，生产方法简单，易操作，生产效率高，得率高，产品质量好，有效解决了β‑葡聚糖的生产，满足工业生产中的实际需要，可有效用于药品、保健品和化妆品，用途广，有显著的经济和社会效益。

A method for extracting bioactive beta glucan from sparasiscrispa mycelium in liquid fermentation

The invention relates to a method for extracting bioactive beta glucan from sparasiscrispa liquid fermentation mycelium, which can effectively solve the problem of high efficiency, low cost, high yield and good quality of production beta glucan, method, culture Hydrangea Mycelium Culture medium, bacteria collected Hydrangea filaments, to medium, with the distilled water was then placed in high pressure homogenizer, was processed by high pressure liquid, centrifugal supernatant, heating, centrifugal, adding anhydrous alcohol, the supernatant and precipitation, centrifugation, the supernatant was removed by ethanol precipitation, to rinse 2 times, collecting precipitation, precipitation was lyophilized, sparasiscrispa beta glucan the present invention, abundant raw materials, simple production process, easy operation, high production efficiency, high yield, good product quality, effective solution to the beta glucan production, meet in industrial production Practical needs, can be effectively used in drugs, health products and cosmetics, wide use, with significant economic and social benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种从绣球菌液体发酵菌丝体中提取生物活性β-葡聚糖的方法
本专利技术涉及化工，特别是一种从绣球菌液体发酵菌丝体中提取生物活性β-葡聚糖的方法。
技术介绍
β-葡聚糖是由葡萄糖通过β-1，3或β-1，4糖苷键形成的生物大分子物质，具有抗菌、抗病毒、抗氧化，防辐射、抑癌、提高免疫力、降血糖、降血脂和改善皮肤等多种生物活性，因而已在药品、保健品和化妆品中广泛应用。其来源主要为燕麦、大麦和酵母及食用菌等真菌，而尤以真菌多糖的生物活性最为明显，真菌多糖以β-1，3葡聚糖为主，并且一般含有以β-1，6糖苷键形成的支链。在已经发现的真菌中，β-葡聚糖含量最高的为绣球菌，其子实体中β-葡聚糖的含量一般都超过其干重的40%，其发酵菌丝体中的β-葡聚糖含量也可以达到20%以上。而绣球菌作为一种食用菌，其来源的β-葡聚糖生物安全性极高，如何能够高效对绣球菌中的葡聚糖进行高效的提取是获得具有生物活性的β-葡聚糖的技术关键。已有的多糖提取方法包括水提取法、酸碱提取法、超声波提取法、微波提取法和酶提取法等，但由于生产方法上存在的问题，一般提取效率只有30%以下，资源浪费大，成本高，产品质量也不尽人意，且操作复杂，因此，如何操作简单、高收率提取具有生物活性的β-葡聚糖是需要认真解决的技术问题。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种从绣球菌液体发酵菌丝体中提取生物活性β-葡聚糖的方法，可有效解决高效、低成本、产量高、质量好生产β-葡聚糖的问题。本专利技术解决的技术方案是，包括以下步骤：（1）、绣球菌菌丝体的培养：将在PDA平板活化室温培养15-20d、直径1cm的绣球菌菌块，接种至装有50mL培养基的容器中，23-25℃、150r/m培养9-11d得绣球菌发酵菌丝体；所述的培养基是由玉米粉20g、酵母粉5g、KH2PO41.0g、MgSO4·7H2O3g、VB10.03g，加水至1000mL混匀制成；（2）、过滤：将步骤（1）培养的绣球菌发酵菌丝体过100目滤网，收集绣球菌菌丝体，用蒸馏水漂洗2-3次，洗去培养基；（3）、匀浆：用匀浆机对洗去培养基的绣球菌菌丝体进行匀浆，10000r/m匀浆1分钟，100目滤网过滤匀浆液，收集滤出液；（4）、高压处理：将滤出液置入高压细胞破碎仪中，在压力为1000-1500个大气压下进行高压处理，流速为10L/h，得高压处理后的液体；（5）、离心：对过高压细胞破碎仪的高压处理后的液体进行离心，15000r/m离心30分钟，收集上清液，弃沉淀；（6）、加热：上清液80-100℃加热10分钟，冷却至23-27℃；（7）、再次离心：对步骤（6）冷却后的上清液进行离心，15000r/m离心30分钟，收集上清液；（8）、在步骤（7）收集的上清液中加入2倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，23-27℃沉淀9-11小时；（9）、对步骤（8）中的溶液进行离心，15000r/m离心30分钟，弃上清液，用体积浓度66%乙醇水溶液对沉淀漂洗2次，收集沉淀；（10）、冻干：将步骤（9）收集的沉淀冻干，得绣球菌β-葡聚糖。本专利技术原料丰富，生产方法简单，易操作，生产效率高，得率高，产品质量好，有效解决了β-葡聚糖的生产，满足工业生产中的实际需要，可有效用于药品、保健品和化妆品，用途广，有显著的经济和社会效益。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作详细说明。本专利技术在具体实施中，可由以下实施例给出。本专利技术在具体实施中，包括以下步骤：（1）、绣球菌菌丝体的培养：取5块PDA平板活化室温培养15-20d、直径1cm的绣球菌菌块，接种至装有250mL培养基的容器中，24℃、150r/m培养10d得绣球菌发酵菌丝体；（2）、过滤：将步骤（1）培养的绣球菌发酵菌丝体过100目滤网，收集绣球菌菌丝体，用蒸馏水漂洗3次，洗去培养基；（3）、匀浆：用匀浆机对洗去培养基的绣球菌菌丝体进行匀浆，10000r/m匀浆1分钟，100目滤网过滤匀浆液，收集滤出液；（4）、高压处理：将滤出液置入高压细胞破碎仪中，在压力为1200个大气压下进行高压处理，流速为10L/h，得高压处理后的液体；（5）、离心：对过高压细胞破碎仪的高压处理后的液体进行离心，15000r/m离心30分钟，收集上清液，弃沉淀；（6）、加热：上清液80-100℃加热10分钟，冷却至23-27℃；（7）、再次离心：对步骤（6）冷却后的上清液进行离心，15000r/m离心30分钟，收集上清液；（8）、在步骤（7）收集的上清液中加入2倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，25℃沉淀10小时；（9）、对步骤（8）中的溶液进行离心，15000r/m离心30分钟，弃上清液，用体积浓度66%乙醇水溶液对沉淀漂洗2次，收集沉淀；（10）、冻干：将步骤（9）收集的沉淀冻干，得绣球菌β-葡聚糖。本专利技术制备方法简单，原料丰富，易生产，节能环保，并经实地测试，本专利技术方法提取绣球菌菌丝体中的β-葡聚糖经过酶法检测其纯度达58%以上，，得率可达66%以上，远远高于现有方法得率30%，而且大大节约了原料，减少了废弃物对环境的污染，并经β-葡聚糖免疫活性检测取得了非常好的技术效果，有关试验资料如下：1、取6-8周BALB/c小鼠1只，颈脱位法杀死，75%酒精浸泡3分钟，在超净工作台中无菌条件下摘取脾脏；2、将脾脏放在200目细胞筛上，用手术剪剪碎，边剪边用无菌PBS冲洗；3、取过滤后的脾脏细胞转移至无菌离心管内，1200r/m离心5分钟；4、用0.4mLPBS重悬细胞，加入2mL的红细胞裂解液，混匀后1200r/m离心5分钟，重复3-4次；5、移除上清，加入2mLRPMI1640培养基重悬细胞，1200r/m离心5分钟，重复1次；6、加入4mLRPMI1640培养基重悬细胞，用血细胞计数板计数后，将小鼠脾脏细胞分入24孔板中，每孔分107个细胞，培养基体积为1.35mL；7、在分装小鼠脾脏细胞的24孔板中加入0.15mL用PBS复溶的绣球菌β-葡聚糖（1mg/mL经0.2μm无菌滤），此时绣球菌β-葡聚糖浓度为0.1mg/mL，对照组加0.15mL的PBS，实验组与对照组均做3个重复；8、将24孔板放置于5%CO2，37℃培养箱中培养4小时后，用RNA提取试剂盒提取小鼠脾脏细胞的总RNA；9、以GAPDH作为对照，用荧光定量PCR的方法检测白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNFα）和干扰素（IFNγ）的mRNA含量的变化，绣球菌β-葡聚糖对白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNFα）和干扰素（IFNγ）有明显的诱导表达作用。并经反复多次试验均取得了相同或相近似的结果，表明本专利技术制备的产品质量稳定，方法可靠，具有很强的实际应用价值，为制备β-葡聚糖开拓了新途径，经济和社会效益显著。本专利技术与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：1、绣球菌子实体生长速度缓慢，所以从绣球菌子实体中提取绣球菌β-葡聚糖，时间成本较高，而本专利技术方法是从生长速度较快的绣球菌液体发酵菌丝体中提取绣球菌β-葡聚糖，原料获取时间可缩短100天左右；2、本专利技术方法提取绣球菌β-葡聚糖的提取率可达66%以上，明显高于已见报道的其他提取方法30%的得率；3、本专利技术方法提取过程中不需要在提取材料中添加酸碱、酶制剂等物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从绣球菌液体发酵菌丝体中提取生物活性β‑葡聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、绣球菌菌丝体的培养：将在PDA平板活化室温培养15‑20d、直径1cm的绣球菌菌块，接种至装有50mL培养基的容器中，23‑25℃、150r/m培养9‑11d得绣球菌发酵菌丝体；所述的培养基是由玉米粉20g、酵母粉5g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 3g、VB1 0.03g，加水至1000mL混匀制成；（2）、过滤：将步骤（1）培养的绣球菌发酵菌丝体过100目滤网，收集绣球菌菌丝体，用蒸馏水漂洗2‑3次，洗去培养基；（3）、匀浆：用匀浆机对洗去培养基的绣球菌菌丝体进行匀浆，10000r/m匀浆1分钟，100目滤网过滤匀浆液，收集滤出液；（4）、高压处理：将滤出液置入高压细胞破碎仪中，在压力为1000‑1500个大气压下进行高压处理，流速为10 L/h，得高压处理后的液体；（5）、离心：对过高压细胞破碎仪的高压处理后的液体进行离心，15000r/m离心30分钟，收集上清液，弃沉淀；（6）、加热：上清液80‑100℃加热10分钟，冷却至23‑27℃；（7）、再次离心：对步骤（6）冷却后的上清液进行离心，15000r/m离心30分钟，收集上清液；（8）、在步骤（7）收集的上清液中加入2倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，23‑27℃沉淀9‑11小时；（9）、对步骤（8）中的溶液进行离心，15000r/m离心30分钟，弃上清液，用体积浓度66%乙醇水溶液对沉淀漂洗2次，收集沉淀；（10）、冻干：将步骤（9）收集的沉淀冻干，得绣球菌β‑葡聚糖。...

【技术特征摘要】
1.一种从绣球菌液体发酵菌丝体中提取生物活性β-葡聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、绣球菌菌丝体的培养：将在PDA平板活化室温培养15-20d、直径1cm的绣球菌菌块，接种至装有50mL培养基的容器中，23-25℃、150r/m培养9-11d得绣球菌发酵菌丝体；所述的培养基是由玉米粉20g、酵母粉5g、KH2PO41.0g、MgSO4·7H2O3g、VB10.03g，加水至1000mL混匀制成；（2）、过滤：将步骤（1）培养的绣球菌发酵菌丝体过100目滤网，收集绣球菌菌丝体，用蒸馏水漂洗2-3次，洗去培养基；（3）、匀浆：用匀浆机对洗去培养基的绣球菌菌丝体进行匀浆，10000r/m匀浆1分钟，100目滤网过滤匀浆液，收集滤出液；（4）、高压处理：将滤出液置入高压细胞破碎仪中，在压力为1000-1500个大气压下进行高压处理，流速为10L/h，得高压处理后的液体；（5）、离心：对过高压细胞破碎仪的高压处理后的液体进行离心，15000r/m离心30分钟，收集上清液，弃沉淀；（6）、加热：上清液80-100℃加热10分钟，冷却至23-27℃；（7）、再次离心：对步骤（6）冷却后的上清液进行离心，15000r/m离心30分钟，收集上清液；（8）、在步骤（7）收集的上清液中加入2倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，23-27℃沉淀9-11小时；（9）、对步骤（8）中的溶液进行离心，15000r/m离心30分钟，弃上清液，用体积浓度66%乙醇水溶液对沉淀漂洗2次...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁文涛，周伏忠，王雪妍，陈晓飞，冯菲，向凌云，宁萌，李志金，陈国参，
申请(专利权)人：河南省科学院生物研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河南,41