对L‑丝氨酸具有改善的耐受性的基因修饰的微生物制造技术

本发明专利技术总体涉及微生物工业，并且具体涉及使用基因修饰的细菌的L‑丝氨酸或L‑丝氨酸衍生物的生产。本发明专利技术提供了基因修饰的微生物，如细菌，其中通过如灭活来减弱编码参与L‑丝氨酸降解的酶的基因的表达，这使得它们特别适用于以较高的产率生产L‑丝氨酸。本发明专利技术还提供了藉此使微生物，且更具体地细菌可以对更高浓度丝氨酸耐受性的方法。本发明专利技术还提供了用于使用这种基因修饰的微生物生产L‑丝氨酸或L‑丝氨酸衍生物的方法。

With tolerance gene modification and improvement in L microbial serine

The present invention relates generally to microbial industry, and in particular relates to the use of genetically modified bacteria L serine or L serine derivatives production. The present invention provides genetically modified microorganisms, such as bacteria, which weakened the expression in L encoding serine degrading enzyme by inactivation of the gene, which makes them particularly suitable for production of high yield L serine. The invention also provides a method for making microbes, and more specific bacteria, for higher concentration of serine tolerance. The invention also provides a method for the use of genetically modified microorganisms producing L serine or L serine derivatives.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对L-丝氨酸具有改善的耐受性的基因修饰的微生物
本专利技术一般涉及微生物工业，且具体涉及使用基因修饰的细菌的L-丝氨酸生产。本专利技术提供了基因修饰的微生物，如细菌，其中编码参与L-丝氨酸降解的酶的基因的表达，通过如灭活而减弱，这使得它们特别适合以较高产率生产L-丝氨酸。本专利技术还提供了通过其使得微生物，且更具体地细菌可以对更高浓度丝氨酸耐性的方法。本专利技术还提供了使用这种基因修饰微生物生产L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物的方法。
技术介绍
L-丝氨酸是目前用于化妆品，制药和医疗行业的氨基酸。丝氨酸的年产量估计在300-1000吨(Leuchtenbergeretal.，2005)。该化合物也因为其作为生物化学基础材料的潜在用途被认为是前30最有意义的生物化学品之一。丝氨酸是用作细胞中产生许多其它氨基酸，如甘氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸的前体的关键氨基酸(Sawers，1998)。除了这些氨基酸之外，丝氨酸也用于生产中间体如O-乙酰丝氨酸(Maier，2003)或异源化合物如乙二醇(Pereiraetal.，2016)。可以由L-丝氨酸通过表达如前所述的丝氨酸脱羧酶产生乙醇胺(Pereiraetal.，2016)。此外，可以由乙醇胺通过脱氨作用生产乙二醇(Pereiraetal.，2016)。甘氨酸源自胞内的L-丝氨酸。甘氨酸的高通量对于生产一系列化合物如硫胺素是期望的(Iwashimaetal.，1971)。目前的生产是基于使用静止细胞(restingcell)的甘氨酸和甲醇的转化(Hagishitaetal.，1996)，其中甲基营养菌会使用丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)将甲醇转化成甲醛并将分子的CH2-OH单元转移到甘氨酸中。这种发酵方法是耗时的，而甘氨酸是昂贵的起始原料。因此开发用于直接由葡萄糖以低成本生产丝氨酸的方法是有吸引力的。丝氨酸具有通过发酵以非常高的理论产率由葡萄糖制成的潜力(BurgardandMaranas，2001)。然而，需要解决几个挑战，才能提高产率，最重要的挑战是在生产生物体中的丝氨酸的降解。丝氨酸在大肠杆菌中具有两种关键的降解途径。丝氨酸至丙酮酸的分解代谢在大肠杆菌中是由三种脱氨酶，即sdaA，sdaB和tdcG催化的，而谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)只具有一种具有对丝氨酸的活性的脱氨酶(sdaA)。在这两种生物体中，丝氨酸转化为甘氨酸是由glyA编码的。通过仅敲除脱氨酶的丝氨酸生产已经在大肠杆菌(Lietal.，2012)和谷氨酸棒杆菌(Peters-Wendischetal.，2005)中尝试。在大肠杆菌中，当仅有一种途径基因(serA)过表达时，会观察到由1g/L葡萄糖的3.8mg/L的瞬时累积。在谷氨酸棒杆菌上的脱氨酶的删除导致丝氨酸滴度的轻微和短暂的增加。在最近的研究中，将大肠杆菌工程化而通过扰乱TCA循环和乙醛酸旁路以增强3-磷酸甘油酸酯的通量(Guetal.，2014)。据报道，所得的菌株，其中只有一种脱氨酶被除去(sdaA)，由75g/L葡萄糖生成了8.45g/L丝氨酸(11.2％的产率)。谷氨酸棒杆菌中的GlyA下调(Peters-Wendischetal.，2005)会导致由40g/L葡萄糖生成9g/L丝氨酸，但导致不稳定的菌株。glyA是将丝氨酸转化为甘氨酸的重要的酶，并且在此步骤中将一个碳单位转移至用作辅因子的四氢叶酸(THF)中。去除叶酸途径和补充叶酸导致稳定的谷氨酸棒杆菌，并产生36g/L丝氨酸，然而，具有相对较低的产率(Stolzetal.，2007)。两种主要的丝氨酸降解途径(丝氨酸至丙酮酸和丝氨酸至甘氨酸)的删除此前尚未实现。此外，还已知的是在缺乏丙酮酸降解途径的菌株中丝氨即使在低浓度下也会变得有毒(ZhangandNewman，2008)。预期的是丝氨酸可以抑制大肠杆菌中支链氨基酸的产生(Hamaetal.，1990)，以及丝氨酸至对细胞有毒性的羟基丙酮酸酯和丙烯酸酯的转化(deLorenzo，2014)。因此，为了有效生产L-丝氨酸或其衍生物，去除丝氨酸降解途径并解决与丝氨酸毒性相关的问题是必须的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供使得更有效地生产L-丝氨酸的方法。更具体地，本专利技术的目的是提供使得以更高的标称产率和改进的质量产率生产L-丝氨酸的方法。这是通过以下发现而实现：通过例如灭活编码参与L-丝氨酸降解的酶的基因，特别是sdaA，sdaB，tdcG和glyA基因可以增强L-丝氨酸的生产。因此，本专利技术在第一方面提供了一种细菌，特别是具有生产L-丝氨酸能力的细菌，其中将所述细菌基因修饰以减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达，和/或减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。更具体地，本专利技术提供了基因修饰为例如通过基因sdaA、sdaB、tdcG和/或glyA的灭活，而减弱这些基因的表达的细菌。本专利技术在第二方面中提供了用于生产L-丝氨酸的方法，包括：在培养基中培养以上描述的细菌。本专利技术在进一步的方面中提供了(分离的)核酸分子，如载体，其包含编码具有与在位置Y356，S357和/或S359包含氨基酸替换的SEQIDNO：11所示的氨基酸序列至少约90％、如至少约93％、在至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。本专利技术在进一步的方面中提供了具有与在位置Y356，S357和/或S359包含氨基酸替换的SEQIDNO：11所示的氨基酸序列至少约90％、如至少约93％、在至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的(分离的)多肽。该(分离的)多肽可以是由本专利技术的细菌表达的(和由其分离的)多肽。本专利技术在进一步的方面中提供了表达具有增加对L-丝氨酸的耐受性的一个或多个氨基酸取代的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变的细菌。本专利技术可以通过以下条目总结：1.一种细菌，修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达和/或减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。2.根据条目1所述的细菌，其中细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达。3.根据条目1或2所述的细菌，其中细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少两种基因的表达。4.根据条目1至3中任一项所述的细菌，其中细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少三种基因的表达。5.根据条目1至4中任一项所述的细菌，其中至少一种编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的基因选自由sdaA、sdaB和tdcG组成的组。6.根据条目1至4中任一项所述的细菌，其中细菌修饰为减弱至少基因sdaA的表达。7.根据条目1至6中任一项所述的细菌，其中所述细菌修饰为减弱至少基因sdaB的表达。8.根据条目1至7中任一项所述的细菌，其中所述细菌修饰为减弱至少基因tdcG的表达。9.根据权利要求1至8中任一项所述的细菌，其中细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。10.根据条目9所述的细菌，其中编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因是glyA。11.根据条目1至10中任一项所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌，所述细菌已经被修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达和/或减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.27 EP 15152643.11.一种细菌，所述细菌已经被修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达和/或减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。2.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因选自由sdaA、sdaB和tdcG组成的组。3.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，所述编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因是glyA。4.根据权利要求1至3中任一项所述的细菌，其中，所述细菌已经被修饰为减弱基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA的表达。5.根据权利要求1至3中任一项所述的细菌，其中，所述细菌已经被修饰为减弱基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至多三种的表达。6.根据权利要求1至5中任一项所述的细菌，其中，通过一种或多种基因的灭活来减弱一种或多种基因的表达。7.根据权利要求1至6中任一项所述的细菌，其中，灭活所述编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因。8.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌，其中，灭活编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的至少一种基因。9.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌，其中，灭活基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至少一种。10.根据权利要求1至9中任一项所述的细菌，其中，灭活基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA。11.根据权利要求1至9中任一项所述的细菌，其中，灭活基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至多三种。12.根据权利要求1至11中任一项所述的细菌，其中，所述细菌能够生长于以至少约6.25g/L的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基中。13.根据权利要求1至12中任一项所述的细菌，其中，所述细菌能够在指数生长期间以至少0.1h-1的生长速率生长于以至少约6.25g/L的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基中。14.根据权利要求1至13中任一项所述的细菌，其中，所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致增加对L-丝氨酸的耐受性的一个或多个氨基酸替换的核苷酸替换。15.根据权利要求1至14中任一项所述的细菌，其中，所述细菌表达具有一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体。16.根据权利要求1至15中任一项所述的细菌，其中，所述细菌在thrA基因内包含一个或多个在编码的多肽中在选自由Y356、S357和S359组成的组的位置处的一个或多个氨基酸替换的核苷酸替换。17.根据权利要求1至16中任一项所述的细菌，其中，所述细菌表达具有在选自由Y356、S357和S359组成的组的位置处的一个或多个氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体。18.根据权利要求1至17中任一项所述的细菌，其中，所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换、一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换和/或一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换；其中位置Y356处的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357处的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；并且位置S359处的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。19.根据权利要求1至18中任一项所述的细菌，其中，所述细菌表达在位置Y356处具有氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体，其中位置Y356处的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组。20.根据权利要求1至19中任一项所述的细菌，其中，所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换，其中位置S357处的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。21.根据权利要求1至20中任一项所述的细菌，其中，所述细菌表达在位置S357处具有氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体，其中位置S357处的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。22.根据权利要求1至21中任一项所述的细菌，其中，所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换，其中位置S359处的替换选自由S359R、S359G、S359M、S3...

【专利技术属性】
技术研发人员：赫曼舒·蒙德哈达，阿列克斯·措夫特高·尼尔森，
申请(专利权)人：丹麦技术大学，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK