【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于生产甜菜素的微生物细胞工厂，特别是酵母工厂。
技术介绍
1、甜菜素(betalains)是特征在于在食品基质中具有鲜艳的红紫色色调的天然水溶性色素。与自然界中的其它植物衍生的色素、特别是大量发现的花青素苷相比，甜菜素作为食品着色剂具有优于它们的特殊特性。这些特性包括更高的水溶性、高达三倍的着色强度以及在3-7范围内的ph稳定性。甜菜素可用于甜品、糖果、干拌料、乳制品和肉制品中。甜菜素不仅用作天然颜料，而且其中一些还具有有益健康的性能。例如，甜菜素甜菜苷被证实在人慢性髓性白血病中诱导细胞凋亡，并且某些甜菜素在体外表现出对hepg2癌细胞的细胞毒性。还已经报道通过向大鼠的饮用水中提供78μg/ml的甜菜苷来抑制诱导的肿瘤。在人类中，证实了每天摄入100mg富含甜菜素的红甜菜浓缩物会显著促进抗炎应答。
2、甜菜素是酪氨酸衍生的色素，存在于例如石竹目(caryophyllales)的植物、真菌鹅膏菌属(amanita)、湿伞属(hygrocybe)中；并且最近发现还存在于细菌重氮营养葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacter diazotrophicus)中。在石竹目植物中，甜菜(betavulgaris)、梨果仙人掌(opuntia ficus-indica)、紫茉莉(mirabilis jalapa)、大花马齿苋(portulaca grandiflora)和光叶子花(bougainvillea glabra)是最知名的产生甜菜素的植物(khan和giridhar2015)。甜菜素最常见地根据化合
3、目前，大多数甜菜素是通过从植物(诸如红甜菜或刺梨类)中提取而获得。植物中甜菜素的含量相当低，例如甜菜苷以300至600mg/kg存在于红甜菜根。此外，最常用的提取方法会导致红甜菜根提取物中存在吡嗪和土臭素，从而使其具有不希望的土臭味(dossantos等人.2018)。
4、通过重组微生物的发酵来重组生产甜菜素将带来更低的成本和更高的纯度。
技术实现思路
1、本专利技术如在权利要求书中所限定。
2、本文提出的专利技术涉及能够生产甜菜素的酵母细胞。甜菜素是一类黄色至紫色的色素，可用作天然食用染料。因此，本文提出的专利技术公开了用于环境友好地生产天然食用染料的酵母细胞平台。
3、本文提供了能够生产一种或多种甜菜素的酵母细胞，所述酵母细胞表达：
4、a.能够羟基化l-酪氨酸并氧化l-dopa的第一异源酶(tyh)，诸如cyp76adα；
5、b.第二异源酶，其为4,5-dopa雌二醇双加氧酶(dod)；和
6、c.具有糖基转移酶活性的第三异源酶，其中所述酶选自：
7、i.seq id no:65所示的藜麦(chenopodium quinoa)糖基转移酶cqsgt2，或与其具有至少70％序列同一性的其功能变体；
8、ii.seq id no:53所示的甜菜(beta vulgaris)糖基转移酶bvsgt2，或与其具有至少70％同一性的其功能变体；
9、iii.seq id no:67所示的光叶子花(bougainvillea glabra)糖基转移酶bggt2，或与其具有至少70％同一性的其功能变体；和
10、iv.seq id no:57所示的甜菜糖基转移酶bvsgt4，或与其具有至少70％同一性的其功能变体；
11、由此所述细胞能够生产一种或多种甜菜素，其中所述一种或多种甜菜素包括一种或多种糖基化的甜菜素，诸如甜菜苷和/或异甜菜苷。
12、本文还提供了能够生产一种或多种甜菜素的酵母细胞，所述酵母细胞表达：
13、a.能够羟基化l-酪氨酸并氧化l-dopa的第一异源酶(tyh)，诸如cyp76adα；第二异源酶，其为4,5-dopa雌二醇双加氧酶(dod)；和具有糖基转移酶活性(诸如选自甜菜苷配基-5-o-葡萄糖基转移酶(b5og)活性和环-dopa-5-o-葡萄糖基转移酶(cdopa5ogt)活性的活性)的第三异源酶，诸如糖基转移酶，诸如东莨菪亭葡萄糖基转移酶(sgt)；由此所述细胞能够生产一种或多种甜菜素，其中所述一种或多种甜菜素包括一种或多种糖基化的甜菜素，诸如甜菜苷和/或异甜菜苷；和/或
14、b.能够羟基化l-酪氨酸并氧化l-dopa的第一异源酶(tyh)，诸如cyp76adα；和第二异源酶，其为在c-末端具有截短的dod(dod*)；由此所述细胞能够生产一种或多种甜菜素，其中所述一种或多种甜菜素包括一种或多种甜菜黄素。
15、本文进一步提供了用于在酵母细胞中生产一种或多种甜菜素的方法，所述方法包括在培养基中孵育酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞表达：
16、a.能够羟基化l-酪氨酸并氧化l-dopa的第一异源酶(tyh)，诸如cyp76adα；
17、b.第二异源酶，其为4,5-dopa雌二醇双加氧酶(dod)；和
18、a.具有糖基转移酶活性的第三异源酶，其中所述酶选自：
19、i.seq id no:65所示的藜麦糖基转移酶cqsgt2，或与其具有至少70％序列同一性的其功能变体；
20、ii.seq id no:53所示的甜菜糖基转移酶bvsgt2，或与其具有至少70％同一性的其功能变体；
21、iii.seq id no:67所示的光叶子花糖基转移酶bggt2，或与其具有至少70％同一性的其功能变体；和
22、iv.seq id no:57所示的甜菜糖基转移酶bvsgt4，或与其具有至少70％同一性的其功能变体；
23、由此所述细胞能够生产一种或多种甜菜素，其中所述一种或多种甜菜素包括一种或多种糖基化的甜菜素，诸如甜菜苷和/或异甜菜苷。
24、本文还提供了用于在酵母细胞中生产一种或多种甜菜素的方法，所述方法包括在培养基中孵育酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞表达：
25、a.能够羟基化l-酪氨酸并氧化l-dopa的第一异源酶(tyh)，诸如cyp76adα；第二异源酶，其为4,5-dopa雌二醇双加氧酶(dod)；和具有糖基转移酶活性(诸如选自甜菜苷配基-5-o-葡萄糖基转移酶(b5og)活性和环-dopa-5-o-葡萄糖基转移酶(cdopa5ogt)活性的活性)的第三异源酶，诸如糖基转移酶，诸如东莨菪亭葡萄糖基转移酶(sgt)，由此所述细胞能够生产一种或多种甜菜素，其中所述一种或多种甜菜素包括一种或多种糖基化的甜菜素，诸如甜菜苷和/或异甜菜苷；和/或
26、b.能够羟基化l-酪氨酸并氧化l-dopa的第一异源酶(tyh)，诸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.能够生产一种或多种甜菜素的酵母细胞，所述酵母细胞表达：
2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞的属选自由酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)或油脂酵母属(Lipomyces)组成的组，诸如所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、布拉氏酵母(Saccharomyces boulardi)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofera)、斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(R
3.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述TYH对于诸如沙马鞭属(Abronia)、喇叭茉莉属(Acleisanthes)、落葵属(Basella)、甜菜属(Beta)、霓花属(Cleretum)、七索藤属(Ercilla)、紫茉莉属(Mirabilis)、仙人掌属(Optunia)或商陆属(Phytolacca)的植物，诸如Abronia nealleyi、Acleisanthes obtusa、落葵(Basellaalba)、甜菜(Beta vulgaris)、彩虹菊(Cleretum bellidiforme)、Ercilla volubis、多花紫茉莉(Mirabilis multiflora)、梨果仙人掌(Optunia ficus-indica)或树商陆(Phytolacca dioica)而言是天然的，或是与其具有至少80％同一性的其功能变体，优选地其中所述TYH选自：
4.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述DOD对于诸如苋属(Amaranthus)、甜菜属(Beta)、叶子花属(Bougainvillea)、紫茉莉属(Mirabilis)、商陆属(Phytolacca)、马齿苋属(Portulaca)、菠菜属(Spinacia)或碱蓬属(Suaeda)的植物，诸如籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)、三色苋(Amaranthus tricolour)、甜菜(Betavulgaris)、光叶子花(Bougainvillea glabra)、紫茉莉(Mirabilis jalapa)、美洲商陆(Phytolacca americana)、大花马齿苋(Portulaca grandiflora)、菠菜(Spinaciaoleracea)或盐地碱蓬(Suaeda salsa)而言是天然的，或是与其具有至少80％同一性的其功能变体，优选地其中所述DOD选自：
5.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中：
6.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达：
7.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中编码所述TYH、所述DOD或具有糖基转移酶活性的酶的基因中的至少一种以高拷贝数存在，诸如其中编码所述TYH、所述DOD或所述具有糖基转移酶活性的酶的基因中的至少一种以至少2个拷贝，诸如至少3个拷贝，诸如至少4个拷贝，诸如至少5个拷贝存在。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达至少两种不同的具有糖基转移酶活性的酶，诸如至少三种不同的具有糖基转移酶活性的酶，诸如至少四种不同的具有糖基转移酶活性的酶。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述一种或多种糖基化的甜菜素在至少一个位置，诸如至少两个位置，诸如至少三个位置被糖基化。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞具有：
11.用于在酵母细胞，诸如解脂耶氏酵母细胞中生产一种或多种甜菜素的方法，所述方法包括在培养基中孵育酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞表达：
12.用于在酵母细胞中生产一种或多种甜菜素的方法，所述方...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.能够生产一种或多种甜菜素的酵母细胞，所述酵母细胞表达：
2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞的属选自由酵母属(saccharomyces)、毕赤酵母属(pichia)、耶氏酵母属(yarrowia)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、假丝酵母属(candida)、红酵母属(rhodotorula)、红冬孢酵母属(rhodosporidium)、隐球菌属(cryptococcus)、丝孢酵母属(trichosporon)或油脂酵母属(lipomyces)组成的组，诸如所述酵母是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、布拉氏酵母(saccharomyces boulardi)、热带假丝酵母(candida tropicalis)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、浅白隐球菌(cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(lipomyces lipofera)、斯氏油脂酵母(lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(rhodotorula glutinis)、出芽丝孢酵母(trichosporon pullulan)或解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。
3.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述tyh对于诸如沙马鞭属(abronia)、喇叭茉莉属(acleisanthes)、落葵属(basella)、甜菜属(beta)、霓花属(cleretum)、七索藤属(ercilla)、紫茉莉属(mirabilis)、仙人掌属(optunia)或商陆属(phytolacca)的植物，诸如abronia nealleyi、acleisanthes obtusa、落葵(basellaalba)、甜菜(beta vulgaris)、彩虹菊(cleretum bellidiforme)、ercilla volubis、多花紫茉莉(mirabilis multiflora)、梨果仙人掌(optunia ficus-indica)或树商陆(phytolacca dioica)而言是天然的，或是与其具有至少80％同一性的其功能变体，优选地其中所述tyh选自：
4.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述dod对于诸如苋属(amaranthus)、甜菜属(beta)、叶子花属(bougainvillea)、紫茉莉属(mirabilis)、商陆属(phytolacca)、马齿苋属(portulaca)、菠菜属(spinacia)或碱蓬属(suaeda)的植物，诸如籽粒苋(amaranthus hypochondriacus)、三色苋(amaranthus tricolour)、甜菜(betavulgaris)、光叶子花(bougainvillea glabra)、紫茉莉(mirabilis jalapa)、美洲商陆(phytolacca americana)、大花马齿苋(portulaca grandiflora)、菠菜(spinaciaoleracea)或盐地碱蓬(suaeda salsa)而言是天然的，或是与其具有至少80％同一性的其功能变体，优选地其中所述dod选自：
5.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中：
6.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达：
7.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中编码所述tyh、所述dod或具有糖基转移酶活性的酶的基因中的至少一种以高拷贝数存在，诸如其中编码所述tyh、所述dod或所述具有糖基转移酶活性的酶的基因中的至少一种以至少2个拷贝，诸如至少3个拷贝，诸如至少4个拷贝...
【专利技术属性】
技术研发人员：I·波罗迪娜，M·巴拜，J·D·戴克耶尔，J·D·科纳，P·廷加德·汤姆森，C·乌苏拉·格利茨，M·塞尔努达·佩斯特，
申请(专利权)人：丹麦技术大学，
类型：发明
国别省市：
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