一种人松弛素2类似物的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种人松弛素2类似物的制备方法。具体的，重组人松弛素2类似物的前体带有一种特殊的新型连接肽，使其前体具有增强的折叠稳定性而显著提高分泌表达效率。在连接肽两端与松弛素肽A‑链和B‑链两个连接点处分别带有切割位点，其前体在真菌细胞中表达后在细胞内运输过程中被切割，从而使细胞向培养基中分泌正确表达、成熟的双链人松弛素2类似物。

Preparation of a human relaxin 2 analogue

The present invention relates to a preparation method of a human relaxin 2 analogue. Specifically, the precursor of recombinant human relaxin 2 analogue has a special new connection peptide, which makes its precursor have enhanced folding stability and significantly improves the secretory expression efficiency. In connection with both ends of the relaxin peptide peptide A chain and B chain two connection points respectively with the cleavage sites, cut its expression in fungal cell precursor cells in the transport process, so that the cells secreted to the medium, the correct expression of double chain relaxation mature 2 analogues.

【技术实现步骤摘要】
一种人松弛素2类似物的制备方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种人松弛素2类似物的制备方法，可以提高人松弛素2类似物在酵母中成熟分泌表达的产量。
技术介绍
松弛素(Relaxin)是一种内源性的具有多种生物活性的肽类激素，由身体自然生成并主要参与调节女性妊娠和分娩时机体的适应性，因能引起耻骨韧带的明显松弛而被命名为Relaxin。Relaxin是一种双链蛋白质，属于胰岛素超家族，其结构特征与胰岛素相似。Relaxin家族包括7个成员，分别为relaxin-1、relaxin-2、relaxin-3、insulin-like(INSL)peptides-3(INSL-3)、INSL-4、INSL-5和INSL-6，其中人体内主要活性存在形式为relaxin-2。人体中松弛素是以松弛素原的形式分泌，松弛素原一级结构是以B链、C肽、A链的形式排列，C肽由108个氨基酸残基组成，松弛素原在体内由相应的蛋白酶酶切加工去除C肽，形成成熟的松弛素。人体中成熟relaxin-2由A、B两条链组成，其中A链有24个氨基酸残基，B链有29个氨基酸残基；A、B链之间由两对链间二硫键相连，A链有一对链内二硫键。研究表明Relaxin的作用比较广泛，包括促进分娩、抑制子宫收缩、刺激乳腺生长与分化和提高精子的运动能力。近年研究发现松弛素因具有较强扩张全身血管、增加心输出量、减少体循环阻力、肺毛细血管楔压以及N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)作用，具有治疗急性心衰的作用。人体内的松弛素主要是妊娠期间由黄体产生的，组织提取困难，临床主要使用动物来源的松弛素。人松弛素作为药物用途的进展迫切需要开发一种能够工业化大规模生产人松弛素的方法，目前比较常见的制备方式包括化学合成法、利用大肠杆菌、酵母、细胞等重组表达的方法，化学合成法首先化学合成A链、B链，然后进行折叠加工，但是较高的二硫键错配率导致产率太低、成本较高而制约了这种方法的使用。若以大肠杆菌E.coli原核表达系统进行重组表达，前体以包涵体形式表达后需要经过细菌裂解，包涵体变复性，酶切，纯化制备等多个步骤得到成熟分子，大肠杆菌不具备将所表达的多肽进行体内折叠的细胞机制，体外变复性过程二硫键容易错配而影响终产率。与大肠杆菌相比，酵母这种真核生物具有蛋白质折叠和二硫键形成等体内加工机制，可以高效分泌表达外源蛋白，目前有很多在酵母中高效表达与松弛素结构较类似的胰岛素的例子，表明酵母是表达重组人松弛素2及其类似物较好的候选系统。EP0163529A公开了在酵母中表达胰岛素类似物的方法，正确表达的胰岛素类似物分泌到培养基中，初步回收后被酶促转化为成熟胰岛素类似物，但是这些酶促步骤通常是昂贵耗时的，且会引入杂质，需要在下游纯化过程中去除，从而增加成本。另外，已有一些报道在酵母中表达松弛素的案例，表达量都很低，无法满足工业化生产的需求。WO2015067113提供了一种可以在酵母中分泌表达成熟人松弛素及其类似物的方法，通过培养含有编码重组人松弛素2及其类似物前体基因的真菌细胞来制备成熟人松弛素2及其类似物，其中所述前体连接肽两端与松弛素肽A-链和B-链两个连接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而使细胞向培养基中分泌正确表达、加工成熟的双链人松弛素2及其类似物。但是带有所述连接肽的分子在酵母中发酵表达量较低，最高只有约15mg/ml。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型连接肽，这种新型连接肽具有特殊的结构，长度优选不超过10个氨基酸残基，且包含至少1个芳香族氨基酸，使其前体具有增强的折叠稳定性而提高分泌表达效率。本专利技术一方面提供了一种人松弛素2类似物前体，为B-C-A形式，其中B是人松弛素2类似物的B-链，A是人松弛素2类似物的A-链，C是将人松弛素2类似物分子的A-和B-肽链连接在一起的连接肽，连接肽的氨基酸序列为KR-X-Y’-KR，其中Y’是1-4个任意氨基酸残基，X为1-2个氨基酸残基，且其紧临Y’的N-末端是芳香族氨基酸残基。进一步地，所述连接肽的氨基酸序列优选自：更多地，在连接肽两端与松弛素肽A-和B-链两个连接点处分别带有切割位点，所述切割位点可以是Kex2切割位点。所述切割位点可以在真菌细胞内被切割。本专利技术所述的人松弛素2类似物，具有下式序列结构：其中A1可以是任意氨基酸，优选除Q、E以外的其它任意氨基酸；B14可以是E、Q、T、D、N或S，优选T、D、N或S。在本专利技术的一个实施方案中，当A1位点为D时，B14位点优选为D。进一步地，本专利技术所述的人松弛素2类似物前体优选表1中的序列：表1人松弛素2类似物前体序列其中R1-R11中人松弛素2类似物的序列为：A链：DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC，B链：DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS。表格中对应序列为：SEQIDNO.1:合成的人松弛素2分子R1前体核酸序列,斜体部分分别是XhoI和NotI酶切位点，下划线部分是Kex2切割位点CTCGAGAAAAGAGATTCCTGGATGGAAGAGGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGACCTTGTCAGAGCACAAATTGCTATCTGCGGAATGTCTACTTGGTCCAAGAGAGAATTCATGTACAAGAGAGATTTGTACTCAGCTCTTGCCAACAAGTGTTGCCATGTTGGTTGTACAAAAAGAAGTTTGGCCAGATTCTGCTAAGCGGCCGCSEQIDNO.2:人松弛素2分子R1前体的氨基酸序列，划线部分为C肽序列DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKREFMYKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO.3:合成的人松弛素2分子R2前体核酸序列,斜体部分分别是XhoI和NotI酶切位点，下划线部分是Kex2切割位点CTCGAGAAAAGAGATTCTTGGATGGAAGAGGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATCTTGTCAGAGCACAAATTGCTATCTGCGGAATGTCTACTTGGTCCAAGAGAGAATTTTCATTGGATAAGAGAGATTTGTACAGTGCTCTTGCCAACAAGTGTTGCCATGTTGGTTGTACAAAAAGATCCCTTGCCAGATTCTGCTAAGCGGCCGCSEQIDNO.4:人松弛素2分子R2前体的氨基酸序列，划线部分为C肽序列DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKREFSLDKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO.5:合成的人松弛素2类似物R3前体核酸序列,斜体部分分别是XhoI和NotI酶切位点，下划线部分是Kex2切割位点CTCGAGAAAAGAGACTCATGGATGGAAGAGGTTATTAAACTTTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCCCAGATTGCTATTTGCGGAATGTCAACTTGGTCCAAGAGAGGTTTTTACGCTAAAAGAGATTTGTATTCTGCATTGGCTAATAAGTGTTGTCATGTTGGATGTACTAAAAGATCATTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人松弛素2类似物前体，其为B‑C‑A形式，其中C是将人松弛素2类似物分子的A‑和B‑肽链连接在一起的连接肽，所述连接肽为KR‑X‑Y’‑KR，其中Y’是1‑4个任意氨基酸残基，X为1‑2个氨基酸残基，且其紧临Y’的N‑末端是芳香族氨基酸残基。

【技术特征摘要】
2016.05.23 CN 20161034585801.一种人松弛素2类似物前体，其为B-C-A形式，其中C是将人松弛素2类似物分子的A-和B-肽链连接在一起的连接肽，所述连接肽为KR-X-Y’-KR，其中Y’是1-4个任意氨基酸残基，X为1-2个氨基酸残基，且其紧临Y’的N-末端是芳香族氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的一种人松弛素2类似物前体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列选自：C1：KREFMYKR，SEQIDNO:23，C2：KREFSLDKR，SEQIDNO:24，C3：KRGFYAKR，SEQIDNO:25，C4：KREFNKR，SEQIDNO:26，C5：KRWKR，SEQIDNO:27，C6：KREFKR，SEQIDNO:28，C7：KRWFKR，SEQIDNO:29，C8：KRLFKR，SEQIDNO:30，C9：KRDWKR，SEQIDNO:31，C10：KRAWFKR，SEQIDNO:32，和C11：KRLWFKRSEQIDNO:33。3.根据权利要求1所述的一种人松弛素2类似物前体，其特征在于，在连接肽两端与松弛素肽A-和B-链两个连接点处分别带有切割位点。4.根据权利要求3所述的一种人松弛素2类似物前体，其特征在于，所述切割位...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宜锋，王宏伟，孔祥林，尹子波，刘衍伟，袁亚菲，喻馗，
申请(专利权)人：江苏恒瑞医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32