干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种干扰素κ（IFN‑κ）在制备抗囊膜病毒药物中的应用，属于抗病毒药物领域。所述IFN‑κ编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述的囊膜病毒包括但不仅限于流感和寨卡病毒;本发明专利技术发现IFN‑κ诱导抗病毒蛋白IFITM3的表达，进而抑制流感病毒和寨卡病毒的感染和复制。IFN‑κ在体外细胞模型中能有效抑制囊膜病毒的感染和复制，减轻由于流感病毒和寨卡病毒大量复制导致的各种病症。上述发现表明IFN‑κ可用于制备抗囊膜病毒的药物，也可用于制备治疗和/或预防囊膜病毒引起的各种病症的药物。

Application of interferon - kappa in preparation of anti - theca virus drugs

The present invention discloses a kind of interferon (IFN kappa kappa) used in the preparation of anti viral drugs in the capsule, which belongs to the field of antiviral drugs. The IFN kappa gene encoding nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 shows, the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:2; the enveloped viruses including but not limited to the flu and Zika virus; the expression of IFN kappa induced antiviral protein IFITM3, thus inhibit the infection and replication the influenza virus and Zika virus. The infection and replication of IFN kappa can effectively inhibit the enveloped virus in vitro cell model, reduce the influenza virus and Zika virus replication of various diseases caused by a large number of. These findings indicate that IFN K can be used for preparing drugs for anti virus capsule, can be used for preparing drugs for the treatment and / or prevention caused by enveloped virus diseases.

【技术实现步骤摘要】
干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用
本专利技术属生物医学
，具体涉及干扰素-kappa(IFN-κ)在制备抗囊膜病毒药物方面的应用。
技术介绍
I型干扰素（IFN-I）家族的多位成员，作为抗病毒药物候选，已经完成临床的药物试验，如重组IFN-α2被应用于抗乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染的治疗药物，IFN-β被应用于治疗多发性硬化症（MS）。I型干扰素家族的另外一位相对较新的成员，于2001年报告的IFN-κ可通过与IFN受体（IFNR）1/2相互作用，激活抗病毒因子的表达。IFN-κ作用机制可能为IFN-κ与受体结合后，刺激酪氨酸激酶2（Tyk2）和Janus激酶1（Jak1）磷酸化，进一步导致信号传导及转录激活因子1/2（STAT1/2）的磷酸化和二聚化，上调干扰素刺激基因（ISG）的表达。这些基因调节广泛的细胞反应，包括抗病毒效应，抗肿瘤效应，增强NK细胞活性以及激活适应性免疫反应。研究表明，在病毒感染或双链RNA刺激，或用IFN-γ和IFN-β处理后，IFN-κ选择性地表达在上皮角质细胞中，活化蛋白激酶R（PKR），2,5-寡腺苷酸合成酶（OAS），和干扰素诱导的GTP结合蛋白（MxA）等抗病毒基因表达，从而抑制脑心肌炎病毒（ECMV）和人类乳头瘤病毒（HPV）的复制。然而，由于ECMV和HPV为无囊膜病毒，其复制机理与囊膜病毒并不一致，无囊膜病毒一般通过受体介导的内吞作用进入细胞，而囊膜病毒通过与细胞膜或内体膜融合，将病毒衣壳和核酸导入细胞中进行复制，因此，无法断定IFN-κ是否同样可以抑制囊膜病毒的复制。囊膜病毒中的流感病毒和寨卡病毒（ZIKV）导致的流感和寨卡疫情造成了重大的公共卫生安全危险，也给社会经济发展造成沉重的负担,目前仍然缺乏有效的疫苗预防感染。已有文献报道，流感病毒可通过与IFN上、下游调节因子结合阻断常见IFN-I信号通路，从而逃逸常见IFN-I的抗病毒作用，而寨卡病毒则可通过阻断STAT1和STAT2磷酸化来逃脱常见IFN-I的抗病毒作用，其他抗病毒小分子药物能有效的改善患者预后，但存在药物选择压力下病毒耐药性突变、以及耐药性病毒传播而导致的部分初次感染患者用药选择困难的风险。因此，迫切需要开发新型抗病毒策略和治疗药物。本专利技术主要发现IFN-κ可抑制多种囊膜病毒的复制，包括流感病毒、寨卡病毒，显示出广谱抗病毒效果。本专利技术将着重阐述IFN-κ对囊膜病毒复制的抑制功能。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是：利用IFN-κ激发宿主的抵抗力，从而抑制囊膜病毒的感染和复制，可用于制备抗囊膜病毒药物。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：提供一种干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用,IFN-κ的来源包括人源、鼠源及其他哺乳动物来源;所述干扰素κ编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,氨基酸序列如SEQIDNo.2所示.所述的囊膜病毒包括但不仅限于流感病毒(H7N9,PR8和H9N2)和寨卡病毒;利用IFN-κ所制备的抗病毒药物可在感染前预防性给药用以预防病毒感染的严重程度；也可在病毒感染后作为治疗性药物给药以降低病毒感染的严重程度；也可自病毒感染前至感染后连续或间隔给药。所述的制备抗囊膜病毒药物包括含有SEQIDNO:1基因序列的各种载体与SEQIDNO:2所述氨基酸序列编码的蛋白。上述载体包括但不限于质粒载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯病毒载体、CMV载体、细胞载体、细菌载体;SEQIDNo2序列编码的蛋白包括单独表达的蛋白与融合表达的蛋白，融合表达的方式包括但不限于与抗体的Fc序列融合、与不同信号肽的融合。此外,SEQIDNo2序列编码的蛋白可使用PEG修饰.本专利技术的有益效果在于：与现有技术相比，本专利技术发现了IFN-κ的新用途，本专利技术所述IFN-κ能抑制囊膜病毒，如流感病毒（包括PR8,H7N9和H9N2）和寨卡病毒的复制，对于预防与治疗高致病流感病毒与寨卡病毒等新发突发传染病有重要的临床应用价值。附图说明图1显示了IFN-κ真核表达载体的构建及IFN-κ蛋白的表达。a，pSV1.0-IFN-κ真核表达载体质粒构建图谱；b，IFN-κ蛋白在293T细胞和细胞上清中成功表达。图2显示了IFN-κ抑制流感病毒PR8,H9N2和H7N9在人非小细胞肺癌上皮细胞系A549中复制。a，蛋白质免疫印迹（WB）结果显示过表达IFN-κ能完全抑制PR8（H1N1）流感病毒核蛋白NP和M1蛋白在A549细胞中的表达；b，蛋白质免疫印迹（WB）结果显示过表达IFN-κ能完全抑制H9N2流感病毒核蛋白NP和M1蛋白在A549细胞中的表达；c，蛋白质免疫印迹（WB）结果显示过表达IFN-κ能抑制H7N9流感病毒核蛋白NP和M1蛋白在A549细胞中的表达。图3显示了IFN-κ抑制寨卡病毒在神经胶质细胞U-251中复制。a，蛋白质免疫印迹（WB）显示转染了IFN-κ质粒的U-251细胞和293T细胞上清都表达大量的IFN-κ蛋白；b，蛋白质免疫印迹（WB）结果显示IFN-κ过表达质粒（左）和细胞上清（右）能抑制寨卡病毒非结构蛋白（NS2b，NS3，NS5）在U-251细胞中的表达；c，免疫荧光统计分析结果显示过表达IFN-κ质粒能抑制寨卡病毒在U-251细胞中复制；d，免疫荧光统计分析结果显示过表达IFN-κ的293T细胞上清能抑制寨卡病毒在U-251细胞中复制。图4显示了IFN-κ上调IFITM3的RNA和蛋白表达水平。a，qPCR检测IFN-κ诱导IFITM3RNA水平上调；b，蛋白质免疫印迹（WB）检测IFN-κ显著上调IFITM3的蛋白表达。注:NC是NativeControl的缩写，代表的是对照组。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术.实施例一：pSV1.0-IFN-κ过表达质粒的构建本专利技术从人基因组中克隆获得了IFN-κ，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,全长氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，本专利技术所述IFN-κ属于I型干扰素家族，其与IFN-α和IFN-β仅有30%的同源性。为了研究IFN-κ的功能，我们构建了IFN-κ的真核表达载体，并在体外细胞系中真核表达出成熟的分泌蛋白，然后检测IFN-κ蛋白对流感病毒和寨卡病毒复制的影响。首先，我们采用真核表达载体pSV1.0构建IFN-κ真核表达质粒，构建方式如下：以A549细胞抽提的RNA反转录生成的cDNA为模板，采用相应的引物进行PCR扩增。PCR反应程序：扩增结束后，在1%的琼脂糖凝胶中分离目的基因，切胶回收，采用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒进行PCR片断回收，将IFN-κ回收产物与pSV1.0载体都采用内切酶BamHⅠ、XbaⅠ双酶切，酶切后再采用T4DNA连接酶将片段和载体4℃连接过夜，第2天将连接产物转化至大肠杆菌E.coliTOP10，在含卡那霉素的培养板上过夜生长。第3天，随机挑取单菌落进行PCR鉴定，挑选阳性克隆再进行双酶切鉴定。再经过测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出IFN-κ基因，质粒构建图谱如图1a。我们进一步检测了IFN-κ能否表达且被分泌到细胞上清中，我们收集了pSV1.0-IFN-κ质粒转染的细本文档来自技高网...

【技术保护点】
干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用。

【技术特征摘要】
1.干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述的IFN-κ来源包括人源、鼠源及其他哺乳动物来源。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，人源IFN-κ编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示,氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。4.根据权利要求1和3所述的应用，其特征在于，所述的制备抗囊膜病毒药物包括含有SEQIDNO:1基因序列的各种载体与SEQIDNO:2所述氨基酸序列编码的蛋白。5.根据权利要求4所应用,其特征在于所述的各种载体包括但不限于质粒载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯病毒载体、CMV载体、细胞载体、细菌载体。6.根据权利要求4所述应用,其特征在于所述SEQIDNo2序列编码的蛋白包括单独表达的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建青，张晓燕，傅卫辉，陈健，何涌泉，
申请(专利权)人：上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：上海,31