体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响生物大分子的动物模型制造技术

本发明专利技术涉及体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响生物大分子的动物模型，具体的涉及一些对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白，无法通过体内试验证明其对肿瘤生物学功能有影响，利用此模型可以有效屏蔽新生血管影响肿瘤生长这一干扰因素。本发明专利技术对现有肿瘤血管生成因子和抑制因子的进一步功能的研究提供可靠模型，为他们的临床应用提供基础，具有重要的意义。

In vivo screening of animal models of biological macromolecules affecting tumor cell biology

The present invention relates to in vivo screening effects in animal models of large biological molecules on tumor cell biology, in particular to a number of tumor angiogenesis gene or protein influence, not through the test in vivo proved its effect on tumor biological function, the model can effectively shield the influence of angiogenesis of tumor growth factors. The present invention provides a reliable model for the further study of the further functions of the tumor angiogenesis factors and the inhibitory factors, and provides the basis for their clinical application, and is of great significance.

【技术实现步骤摘要】
体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响生物大分子的动物模型
本专利技术属于动物模型制备领域，具体涉及一种用于体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响生物大分子的动物模型及其应用，更具体的涉及一些对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白，无法通过体内试验证明其对肿瘤生物学功能有影响，利用此模型可以解决该瓶颈。
技术介绍
肿瘤生长依赖于血管生成的概念始于20世纪70年代初，但其重要意主并未受到重视。近十年，由于发现了血管生成因子对血管生成的作用，以及血管生成对肿瘤生长和侵入转移、特别对肿瘤早期发生的重要影响，肿瘤血管生成成为近年来肿瘤研究的热点之一，为肿瘤治疗开辟了一个新的思路。目前已经报道了很多相关蛋白和因子，包括肿瘤血管生成因子和肿瘤血管生成抑制因子。但是，其中很多蛋白和因子没有进一步研究验证其是否对肿瘤细胞生物学有影响。这主要受制于目前的实验技术。肿瘤血管生成常用的体内实验有鸡胚绒毛尿囊膜实验、角膜微囊实验、海绵植入实验、圆盘血管生成系统、基质胶栓实验、海绵-基质胶实验，鸡胚绒毛尿囊膜实验使用鸡胚为实验体，鸡属于鸟纲，与哺乳动物有差距，角膜微囊实验需要在显微镜下手术，用刀片在靠近瞳孔的角膜上作1.5-2mm长的切口，不切透角膜，再用自制的虹膜铲沿眼球的弧度从切口向角巩膜缘推进，形成一个1.5mm×0.8mm大小的微囊，需要很精细的操作，不容易掌握，海绵植入皮下容易引起炎症反应等。本专利技术的目的在于提供一种用于体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响基因的动物模型及其应用，对一些对肿瘤血管生成有影响的基因，想验证其是否对肿瘤细胞生物学有影响时，利用此模型可以有效屏蔽新生血管影响肿瘤生长这一干扰因素。本专利技术对现有肿瘤血管生成因子和抑制因子的进一步功能的研究提供可靠模型，为他们的临床应用提供基础，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响的生物大分子的动物模型，模型制备方法包括：(1)采用微囊技术将肿瘤细胞微囊化处理，形成肿瘤细胞微囊复合体；(2)检测微囊囊壁是否符合半透膜微孔径标准；(3)将肿瘤细胞微囊复合体分组植入裸鼠皮下不同区域，观察各组肿瘤细胞微囊复合体与机体的生物相容性及有无毒副作用；(4)移植后，在其中一组肿瘤细胞微囊复合体周围注射待检测生物大分子作为刺激组，在另一组肿瘤细胞微囊复合体周围先注射待检测生物大分子阻断剂后注射待检测生物大分子作为阻断组，对照组肿瘤细胞微囊复合体周围注射生理盐水；(5)每隔1-7天重复步骤(4)，3-15次后终止实验；(6)将各组植入皮下的肿瘤细胞微囊复合体取相同数量经破囊后收集囊内细胞团块，进行肿瘤细胞生物学检测。进一步，生物大分子包括蛋白质、基因、碳氢化合物，优选的，生物大分字为基因或蛋白。优选的，生物大分子指对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白，更优选的，肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白包括肿瘤血管生成因子和肿瘤血管生成抑制因子。肿瘤血管生成因子一般包括VEGF及其受体家族、细胞外基质与基质金属蛋白酶、ETs家族成员、纤维母细胞生长因子家族及其受体、血小板源内皮细胞生长因子，具体如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、血小板起源生成长因(PDGF)、血小板活化因子(PAF)、转化生长因子α(TGF-α)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白细胞介素-1、4、6、8、15(IL-1、4、6、8、15)、血管生成素、纤连蛋白、肿瘤坏死因子α、内毒素、金属蛋白酶(MMP)等；肿瘤血管生成抑制因子主要包括大分子蛋白前体酶解片段、细胞因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂和抑癌基因，具体如血小板反应蛋白(TSP)、Angiostatin(血管抑制)、endostatin(内皮抑制)、苏拉明、干扰素α、β、γ、干扰素μ诱导的蛋白10、白细胞介素-12(IL-12)、血小板因子4等。进一步，对肿瘤细胞生物学的影响是指对肿瘤细胞的周期、增殖、粘附、侵袭、迁移及凋亡的影响。优选的，流式细胞检测细胞周期。优选的，采用MTT实验检测细胞增殖。优选的，使用酶标仪检测细胞粘附。优选的，采用Transwell小室技术检测细胞侵袭。优选的，采用划痕实验方法检测细胞迁移。优选的，采用荧光双染技术以及流式检测细胞凋亡。肿瘤细胞微囊化是用一层半透膜将细胞包裹在珠状的微囊里，从而使生物大分子和肿瘤细胞不能从微囊里溢出，而小分子的物质、培养基的营养物质可自由出入半透膜。微囊囊材选自明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、淀粉、壳聚糖、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚氨酯等。优选的，微囊囊材为海藻酸钠。微囊制备方法包括物理化学法、化学法和物理机械法等3大类，物理化学法包括相分离法(单凝聚法、复凝聚法、溶剂-非溶剂法、改变温度法)、液中干燥法；化学法包括界面聚合法、单体聚合法、辐射法、液中硬化包衣法；物理机械法包括喷雾干燥法、喷雾冷凝法、空气悬浮包衣法、静电沉积法、多乳离心法、锅包法。进一步，半透膜微孔径为5-200nm，优选的，半透膜微孔径为50-100nm。进一步，肿瘤细胞微囊复合体周围分1-3个点注射生物大分子。进一步，肿瘤细胞微囊复合体周围先注射待检测生物大分子阻断剂后10-60分钟后注射待检测生物大分子。优选的，生物大分子浓度为0-50μg/m1。优选的，在制备动物模型前，将肿瘤细胞分成3-10组，每组采用含不同浓度生物大分子的无血清培养基，各组每天MTT检测一次，连续检测5-7天，根据MTT检测值绘制不同生物大分子浓度作用下肿瘤细胞生长曲线，从中选出最佳的生物大分子浓度。优选的，生物大分子阻断剂浓度为0.2-2μg/105个细胞。优选的，在制备动物模型前，将肿瘤细胞分成3-10组，每组采用含不同浓度生物大分子阻断剂的无血清培养基，10-60分钟后注射待检测生物大分子，培养2-4天后MTT实验检测。进一步，每隔1-4天重复步骤(4)，2-4周后终止实验。优选的，生物大分子为TSP-1蛋白。优选的，生物大分子阻断剂为CD36和/或CD47。优选的，TSP-1蛋白浓度为0-50μg/m1，更优选的，TSP-1蛋白浓度为40μg/m1。优选的，生物大分子阻断剂CD36和/或CD47浓度为0.2-2μg/105个细胞，更优选的，生物大分子阻断剂CD36和/或CD47浓度为1μg/105个细胞。附图说明图1是分离纯化出口腔唾液腺MEC细胞图；(A)高分化唾液腺MEC组织块培养第5天(×100)；(B)中分化唾液腺MEC组织块培养第5天(×100)；(C)低分化唾液腺MEC组织块培养第5天(×100)；(D)高分化唾液腺MEC细胞培养第二代(×100)；(E)中分化唾液腺MEC细胞培养第二代(×100)；(F)低分化唾液腺MEC细胞培养第二代(×100)；(G)高分化唾液腺MEC细胞培养第十代(×100)；(H)中分化唾液腺MEC细胞培养第十代(×100)；(I)低分化唾液腺MEC细胞培养第十代(×100)；图2是不同分化程度的唾液腺MEC中TSP-1的表达图图3是WB方法检测唾液腺MEC中TSP-1，CD36及CD47的表达图图4是最佳细胞接种浓度检测图图5是最佳TSP-1作用浓度检测图图6是细胞增值指数及MTT检测OD值图图7是细胞粘附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响的生物大分子的动物模型，模型制备方法包括：(1)采用微囊技术将肿瘤细胞微囊化处理，形成肿瘤细胞微囊复合体；(2)检测微囊囊壁是否符合半透膜微孔径标准；(3)将肿瘤细胞微囊复合体分组植入裸鼠皮下不同区域，观察各组肿瘤细胞微囊复合体与机体的生物相容性及有无毒副作用；(4)移植后，在其中一组肿瘤细胞微囊复合体周围注射待检测生物大分子作为刺激组，在另一组肿瘤细胞微囊复合体周围先注射待检测生物大分子阻断剂后注射待检测生物大分子作为阻断组，对照组肿瘤细胞微囊复合体周围注射生理盐水；(5)每隔1‑7天重复步骤(4)，3‑15次后终止实验；优选的，每隔1‑4天重复步骤(4)，2‑4周后终止实验；(6)将各组植入皮下的肿瘤细胞微囊复合体取相同数量经破囊后收集囊内细胞团块，进行肿瘤细胞生物学检测。

【技术特征摘要】
1.一种用于体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响的生物大分子的动物模型，模型制备方法包括：(1)采用微囊技术将肿瘤细胞微囊化处理，形成肿瘤细胞微囊复合体；(2)检测微囊囊壁是否符合半透膜微孔径标准；(3)将肿瘤细胞微囊复合体分组植入裸鼠皮下不同区域，观察各组肿瘤细胞微囊复合体与机体的生物相容性及有无毒副作用；(4)移植后，在其中一组肿瘤细胞微囊复合体周围注射待检测生物大分子作为刺激组，在另一组肿瘤细胞微囊复合体周围先注射待检测生物大分子阻断剂后注射待检测生物大分子作为阻断组，对照组肿瘤细胞微囊复合体周围注射生理盐水；(5)每隔1-7天重复步骤(4)，3-15次后终止实验；优选的，每隔1-4天重复步骤(4)，2-4周后终止实验；(6)将各组植入皮下的肿瘤细胞微囊复合体取相同数量经破囊后收集囊内细胞团块，进行肿瘤细胞生物学检测。2.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，生物大分字为基因或蛋白；优选的，生物大分子指对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白。3.根据权利要求2所述的动物模型，其特征在于，肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白包括肿瘤血管生成因子和肿瘤血管生成抑制因子。4.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，对肿瘤细胞生物学的影响是指对肿瘤细胞的周期、增殖、粘附、侵袭、迁移及凋亡的影响。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨森，郭丽娟，
申请(专利权)人：遂宁市中心医院，
类型：发明
国别省市：四川,51