一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用，所述鼓泡状引物为核酸单链结构，所述鼓泡状引物包括依次相连的四个部分：5p臂、通用序列、分子标签和3p臂；所述5p臂在鼓泡状引物的5’端，且在第一轮PCR反应中，根据碱基互补配对原则与模板序列结合；所述通用序列在第一轮PCR反应中，与模板DNA序列不互补而呈凸起的鼓泡状，且所述通用序列与第二轮PCR反应中的通用引物的3’端序列至少有一部分相同；所述分子标签由多个简并碱基组成；所述3p臂在鼓泡状引物的3’端，且根据碱基互补配对原则与模板序列结合。本发明专利技术鼓泡状引物大大的提高了测序数据的分析检测灵敏性，可以同时进行多个位点和多种类型的检测，检测灵敏度高、通量高、准确度高，适用于多种肿瘤的检测。

A bubbling primer and its kit and Application

The invention relates to a bubble primer composition and kit and application, the bubble structure of single stranded nucleic acid primers, the bubble primer includes four parts which are connected in sequence: 5p arm, universal sequence, molecular tags and 3P arm; the 5P arm in a bubble shaped primer the 5 'end, and in the first round of the PCR reaction, according to the principle of complementary base combined with the template sequence; the general sequence in the first round of the PCR reaction, not complementary to the template DNA sequence was raised bubble, 3' end sequence primers and the universal sequence and the second round of the PCR reaction the at least one part of the same; the molecular label is composed of a plurality of degenerate bases; the 3P arm in the 3 'end of bubble primer, and according to the principle of complementary base sequence and template combination. The bubbling primer of the invention greatly improves the sensitivity of the analysis and detection of the sequencing data, and can simultaneously carry out multiple loci and multiple types of detection. The detection has high sensitivity, high throughput and high accuracy, and is suitable for detection of various tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用
本专利技术属于生物
，涉及医学分子诊断及生物技术，涉及一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用。
技术介绍
近10多年来，癌症的发病率明显上升，其中肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，5年生存率仅为16.8％，每年新确诊肺癌患者达到160万。同时肺癌也是癌症患者死亡的首要病因，每年有140万的人口死于肺癌。根据《2015年中国癌症统计》报道，预计2015年中国约有429.2万癌症新发病例，281.4万癌症死亡病例。其中。肺癌以新发病例73.3万例(占整体17.1％)、死亡病例61万例(占整体21.1％)，成为中国人罹癌或因癌致死的最大威胁。另外种族、家属史与吸烟对肺癌的发病均有影响。临床上对肺癌有一个简单的分法，将之分为小细胞肺癌(缩写SCLC)以及非小细胞肺癌(缩写NSCLC)。小细胞肺癌约占所有肺癌病理类型中的15％，非小细胞肺癌约占所有肺癌病理类型中的85％。这两种类型的肺癌的治疗方案是截然不同的。小细胞肺癌患者主要用化学疗法治疗，外科手术治疗对这种类型肺癌患者并不起主要作用。但是，外科手术治疗对非小细胞肺癌患者来说确实是一个很重要的治疗手段。目前对于肺癌的检测包括X-射线扫描、CT、PET-CT、核磁共振、穿刺活检等，但是大于70％的患者确诊时已处于癌症晚期。肿瘤的治疗效果与肿瘤的早期发现有很大的关系，越早发现就越有可能治愈。传统的肺癌治疗方式包括外科手术治疗、放疗和化疗等。外科手术治疗虽然可以切除肿瘤，但是手术过程中可能无法完全切除或引起肿瘤转移，还可能造成器官损伤及身体免疫力降低；化疗是一种全身性的治疗，效果明显和迅速，在某些肿瘤方面可以达到手术切除的效果，但放疗成本高，周期长，并发症也较多。靶向治疗，由于其毒性小，副作用少并且能够大大提升患者生存周期以及生活质量而得到广泛的应用。但与此同时，靶向药物的选择依赖于患者的基因分型，靶向药物往往有其对应的靶基因，当该基因发生突变时某条调控细胞增殖分裂的信号通路被持续激活，或者是调控细胞凋亡的信号通路被抑制，当使用相应的靶向药物之后，该通路被阻断，肿瘤细胞被杀死。现有的肿瘤基因检测方法主要包括Sanger测序、QPCR、Fish、IHC等。CN105969857A公开了一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，该方法基于多重PCR和高通量测序技术开发出一种用于检测12个致癌基因的466个突变的方法，所述的致癌基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。CN103305625A公开一种检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法及试剂盒与应用，该方法包括如下步骤：设计扩增非小细胞肺癌七种相关基因外显子区段的扩增引物，共15对，将扩增引物分组配制成扩增引物混合液，分为6组，使用扩增引物混合液分别对待检样品进行多重PCR扩增后进行酶消化；设计用于检测突变热点位点的延伸引物，共39条，将延伸引物分组配制成延伸引物混合液，对应于扩增引物混合液，也为6组，将前述消化后的PCR产物进行延伸反应，接着酶消化，得到的产物进行毛细管电泳，通过软件分析，作出结果判断。这些方法基本上都只能针对若干个已知的基因突变信息进行检测，具有检测基因的数量少，且敏感度低，实际需要DNA起始量大等缺点。病人使用某个试剂盒检测后，往往只能够对于有限的某几种药物进行指导。当有其他的用药需求时，还需要重新进行额外检测，并且Fish、IHC等方法对于实验人员操作要求较高。因此，针对肿瘤的靶基因以及其驱动基因的检测技术的开发是应用靶向治疗的基础，研发一种为肿瘤早期诊断提供参考信息的检测技术迫在眉睫。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供了一种鼓泡状引物及其应用，本专利技术鼓泡状引物大大的提高了测序数据的分析检测灵敏性，可以同时进行多个位点和多种类型的检测，检测灵敏度高、通量高、准确度高，适用于多种肿瘤的检测。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种鼓泡状引物(BubblePrimer)，所述鼓泡状引物为核酸单链结构，所述鼓泡状引物包括依次相连的四个部分：5p臂、通用序列、分子标签和3p臂；所述5p臂在鼓泡状引物的5’端，且在第一轮PCR反应中，根据碱基互补配对原则与DNA模板序列结合；所述通用序列在第一轮PCR反应中，与模板序列不互补而呈凸起的鼓泡状，且所述通用序列与第二轮PCR反应中的通用引物的3’端序列至少有一部分相同；所述分子标签由多个简并碱基组成；所述3p臂在鼓泡状引物的3’端，且根据碱基互补配对原则与模板序列结合。本专利技术中，所述鼓泡状引物包括正向鼓泡状引物和反向鼓泡状引物，所述正向鼓泡状引物和反向鼓泡状引物都是由所述四个部分组成，所述鼓泡状引物的结构为：正向鼓泡状引物：5p臂+通用序列+分子标签+3p臂；反向鼓泡状引物：5p臂+通用序列+分子标签+3p臂。本专利技术中，所述3p臂、5p臂和通用序列本领域技术人员都可以根据需要检测的疾病的相关基因进行设计，随着需要检测的疾病的相关基因的不同，所述3p臂、5p臂和通用序列均不相同，若同一个疾病有多个相关基因要同时进行检测，可以设计多对鼓泡状引物从而实现一次性检测多个位点。根据本专利技术，所述鼓泡状引物中的5p臂的长度为16-30nt，例如可以是16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt或30nt，优选为20-25nt。根据本专利技术，所述鼓泡状引物中的通用序列的长度为20-25nt，例如可以是20nt、21nt、22nt、23nt、24nt或25nt，优选为22-23nt。根据本专利技术，针对不同疾病的检测，所述通用序列是固定的，在第二轮PCR反应中，所述通用序列结合到第一轮PCR扩增产物上，在DNA聚合酶的作用下进行延伸。根据本专利技术，所述通用序列为如SEQIDNO.1-2所示的核酸序列，所述SEQIDNO.1-2所示的核酸序列如下：正向通用序列(SEQIDNO.1)：5’-CGACATGGCTACGATCCGACTT-3’；反向通用序列(SEQIDNO.2)：5’-TAAGACCACTTGACCGTCAGCAT-3’。根据本专利技术，所述所述分子标签的长度为3-10nt，例如可以是3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt或10nt，优选为7nt。本专利技术中，所述分子标签有3-10个简并碱基N可以进行选择，其中N代表着A/T/C/G四种中的任一种，根据排列组合公式，可列出分子标签所对应的不同碱基序列排列方式有46-420种选择。如：分子标签为6个简并碱基N时，则有46中碱基排列方式，即4096个分子标签选择。由于是由多个简并碱基N组成，其分子标签排列方式便有多种选择，所述鼓泡状引物加上分子标签后仍然是简并的，但具体到每个引物，其具有特定的序列，保证了得到的每个原始模板在原始文库里都具有独一无二的分子标签序列，从而大大提高了测序数据分析的检测灵敏性。根据本专利技术，所述鼓泡状引物中的3p臂的长度为5-15nt，例如可以是5nt、6nt、7n本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鼓泡状引物，其特征在于，所述鼓泡状引物为核酸单链结构，所述鼓泡状引物包括依次相连的四个部分：5p臂、通用序列、分子标签和3p臂；所述5p臂在鼓泡状引物的5’端，且在第一轮PCR反应中，根据碱基互补配对原则与DNA模板序列结合；所述通用序列在第一轮PCR反应中，与模板序列不互补而呈凸起的鼓泡状，且所述通用序列与第二轮PCR反应中的通用引物的3’端序列至少有一部分相同；所述分子标签由多个简并碱基组成；所述3p臂在鼓泡状引物的3’端，且根据碱基互补配对原则与模板序列结合。

【技术特征摘要】
1.一种鼓泡状引物，其特征在于，所述鼓泡状引物为核酸单链结构，所述鼓泡状引物包括依次相连的四个部分：5p臂、通用序列、分子标签和3p臂；所述5p臂在鼓泡状引物的5’端，且在第一轮PCR反应中，根据碱基互补配对原则与DNA模板序列结合；所述通用序列在第一轮PCR反应中，与模板序列不互补而呈凸起的鼓泡状，且所述通用序列与第二轮PCR反应中的通用引物的3’端序列至少有一部分相同；所述分子标签由多个简并碱基组成；所述3p臂在鼓泡状引物的3’端，且根据碱基互补配对原则与模板序列结合。2.根据权利要求1所述的鼓泡状引物，其特征在于，所述5p臂的长度为16-30nt，优选为20-25nt；优选地，所述通用序列的长度为20-25nt，优选为22-23nt；优选地，所述通用序列为如SEQIDNO.1-2所示的核酸序列；优选地，所述分子标签的长度为3-10nt，优选为7nt；优选地，所述3p臂的长度为5-15nt，优选为8-15nt。3.一种如权利要求1或2所述的鼓泡状引物用于制备肿瘤相关突变热点基因的检测试剂盒的应用；优选地，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌或卵巢癌中的任意一种或至少两种的组合。4.一种用于检测非小细胞肺癌相关突变热点基因的鼓泡状引物，其特征在于，所述鼓泡状引物的正向引物如SEQIDNO.3-74所示，所述鼓泡状引物的反向引物如SEQIDNO.75-146所示。5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的鼓泡状引物和/或如权利要求4所述的用于检测非小细胞肺癌相关突变热点基因的鼓泡状引物；优选地，所述试剂盒还包括用于第二轮PCR反应的通用引物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述通用引物包括正向通用引物和反向通用引物；优选地，其中所述通用引物的正向通用引物和反向通用引物的3’端序列分别与所述的鼓泡状引物的正向鼓泡状引物和反向鼓泡状引物中的通用序列至少部分相同；优选地，所述正向通用引物的核酸序列如SEQIDNO.147所示；优选地，所述反向通用引物的核酸序列为SEQIDNO.148-235中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括PCR缓冲液PfuTurboCxDNA聚合酶和纯水；其中，所述PCR缓冲液包括10×PfuTurboCx缓冲液、dNTPs、二甲基亚砜、甜菜碱和硫酸镁；进一步优选地，所述dNTPs是浓度为0.1mM-25mM的dNTPs混合液；所述甜菜碱是摩尔浓度为1M-4M的甜菜碱溶液；所述二甲基亚砜是质量百分浓度为100％的二甲基亚砜；所述硫酸镁是摩尔浓度为1mM-1M的硫酸镁溶液；所述DNA聚合酶为PfuTurboCx热启动DNA聚合酶。7.一种文库的构建方法，其特征在于，采用如权利要求1、2或4中任一项所述的鼓泡状引物，包括如下步骤：1)提取样本核酸；2)第一轮PCR反应，捕获目的基因编码序列：以步骤(1)所述核酸为模板，采用所述鼓泡状引物进行第一轮PCR反应，获得第一轮PCR扩增产物；3)纯化：纯化步骤2)获得的第一轮PCR扩增产物；4)第二轮PCR反应，构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：江媛，魏汉敏，刘鹏娟，黎美燕，程云阳，赵霞，章文蔚，拉多杰·德马纳克，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44