基于梅花鹿全基因组开发的STR分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了基于梅花鹿全基因组开发的STR分子标记及其应用。以梅花鹿全基因组序列为基础进行STR位点筛选、引物设计及应用效果验证，最终获得高扩增效率、高识别率的梅花鹿STR分子标记，用于扩增所述STR分子标记的引物序列分别如SEQ ID NO:1‑62所示。本发明专利技术开发的梅花鹿STR位点含有4碱基重复单元，较常规的2‑3碱基重复单元辨识度更高、更稳定，基因判型更容易；可以为梅花鹿群体遗传学研究提供便捷有效的分子标记。

【技术实现步骤摘要】
基于梅花鹿全基因组开发的STR分子标记及其应用
本专利技术涉及动物资源学、分子生物学和生物信息学领域，具体地说，涉及基于梅花鹿全基因组开发的STR分子标记及其应用。
技术介绍
随着各类哺乳动物基因组计划的完成，测序技术和生物信息学分析技术的飞速发展，人们的目光越来越多地集中在特种经济动物遗传资源的评价、保护和利用上，特别是梅花鹿遗传资源。由于野生梅花鹿具有特殊的药用价值，我国在公元前14—12世纪就开始对野生梅花鹿进行家养化利用，是世界上养殖梅花鹿最早的国家，同时也是最早将梅花鹿产品应用于医药保健的国家，主要用于中药和保健品原料。目前我国的野生梅花鹿己十分罕见，仅存在于一些片段化生境中，其分布区正在不断缩减，野生梅花鹿已处于濒危状态，早已被列入中国国家一级保护动物，中国濒危动物红皮书：濒危。对于梅花鹿遗传资源的评价和利用，指的是家养梅花鹿，由野生东北梅花鹿驯化而来。野生梅花鹿经过多年人工驯养，变得温顺，适应性强，生产力和遗传力稳定，成为发展养鹿业的物质基础和有力保证。但由于单纯追求高效益，没有相应的原种保护措施，已使家养梅花鹿6个选育品种和1个品系种质资源的保留受到品种间杂交和种间杂交的影响，这些品种都不同程度退化和改变，有些品种呈现下降或灭绝趋势。此外，梅花鹿养殖过程中，错误的系谱记录非常普遍，对后续的遗传力评价和育种值预测产生了不良影响。养鹿业的持续发展不仅仅是鹿茸产量的持续提高，也包括了未来市场对质量和品种的需求，因此需要储备更多的遗传资源以适应未来环境的变化。现阶段我们需要科学、合理地评价中国的家养梅花鹿资源，制定合理的保种计划，并采取切实可行的保种措施，才能保证养鹿业的可持续发展。开发遗传标记构建分子系谱，对其群体内和个体间的遗传关系有了进一步的了解，建立系谱用于梅花鹿育种改良，配种方案的制定、血缘关系、近交率的确定，以及群体遗传参数的估计，进而提高梅花鹿群体总体质量，另一方面也可以为梅花鹿遗传资源的有效保护提供理论依据。短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)又称微卫星DNA(microsatelliteDNA)，是一种高度重复序列，由核心序列和侧翼序列构成。核心序列碱基数为1-6bp，其中核心序列为1-4bp的微卫星最为常见。核心序列的重复数决定了微卫星标记多态性，而侧翼序列将微卫星特异定位于染色体的某一位置。在真核生物的染色体上存在大量的微卫星位点。微卫星标记是一种中性遗传标记，不编码蛋白质和RNA，但既可以分布于基因组的编码区，也可以分布非编码区。分布于非编码区的微卫星标记是最为常见的遗传标记，因为它不受选择压的影响，能够从根本上反映变异的进程，而分布于编码区的微卫星标记则有可能由于影响的蛋白质功能而受到选择的影响。STR位点在基因传递过程中遵循孟德尔共显性方式遗传，因其片段短、扩增效率高、判型准确等特点，已广泛应用于法医学个体识别和亲子鉴定等领域。自1990年初以来，微卫星标记广泛适用于人口结构和父权分析，它相对廉价，相比二等位标记，如单核苷酸多态性，它的每个标记基因型会提供更多的群体遗传信息。STR位点的开发就是检测出STR两侧的核苷酸序列，以此作为设计PCR扩增引物的根据，以便在不同品种或不同个体间扩增出多态性微卫星DNA片段。用于微卫星标记的开发技术归纳起来主要有6种，分别是：直接文库筛选法、基于锚定PCR技术的方法、单引物延伸富集法、选择杂交富集法、SSR转移扩增法、生物信息学方法。基因组文库筛选法是最经典的开发微卫星标记的方法，即通过构建基因组文库、筛选文库、阳性克隆测序获得微卫星序列。构建基因组文库一般是采用限制性内切酶将基因组DNA消化为小片段，也可以采用超声波或喷雾器等方法，然后将小片段连入载体转入大肠杆菌，这样就构建成了基因组文库。文库的筛选通常用同位素标记的微卫星探针杂交筛选，最终通过测序获得微卫星序列，根据侧翼序列设计引物。但是筛选基因组文库工作量大，效率低，因此仅适用于基因组中微卫星含量高的物种。基于锚定PCR技术的方法是利用5’锚定简并引物以基因组DNA为模板进行扩增，再将扩增产物连入载体进行克隆测序获得微卫星标记的方法。2001年在锚定PCR法的基础上，又专利技术了两种开发微卫星标记的方法，SAM和STMP。SAM即选择扩增微卫星法(SelectivelyAmplifiedMicrosatellite)，它是5’锚定PCR技术与选择性扩增微卫星多态性位点相结合的产物，是将两个人工接头序列连接到双酶切的DNA片段两端，先后经抑制性PCR、选择性PCR和SAMPCR三步得到含SSR重复序列的扩增产物，再用聚丙烯酰胺凝胶分离、回收、克隆，测序后分别设计引物。STMP则是序列标签微卫星法(Sequence-TaggedMicrosatelliteProfiling)，它是利用基因表达序列分析原理，建立富含微卫星序列的标签文库，快速大通量的分离单位点微卫星序列。该法过程较为繁琐。单引物延伸富集法是用噬菌粒构建基因组文库，随后用辅助噬菌体超感染产生单链环状DNA，以此为模板，微卫星序列作引物进行延伸反应，形成双链环状DNA，然后转化大肠杆菌建成微卫星富集文库。该方法包含过多的步骤，操作复杂，而且对大肠杆菌菌种要求特殊，因此，其应用受到一定的限制。选择杂交富集法是目前应用最为广泛的SSR分离方法，该方法操作简单，易于掌握。其原理是首先对基因组DNA进行片段化处理，接着进行大小选择，回收大小在200-1000bp之间的片段，随后在回收片段两端连接一个接头分子，由于该接头含有后续引物结合序列，因此可用以扩增连有接头的DNA分子及杂交后富集扩增。连有接头的DNA片段随后便与固定在尼龙膜上的SSR探针进行杂交，也可以与生物素标记的SSR探针进行杂交。经杂交富集的片段洗脱后用接头序列特异引物进行扩增，连接到克隆载体转化大肠杆菌形成富集文库。SSR转移扩增法，SSR侧翼序列在亲源关系较近的物种之间具有保守性，因此可以在近缘物种之间转移扩增。但研究认为植物SSR的种间扩增仅限于同属植物或密切相关的属间，并且这些能够转移的SSR很可能属基因内SSR，其多态性不高。生物信息学方法是利用生物学软件从GenBank、DDBJ、EMBL等公共数据库中检索SSR序列，是一种简便快捷的方法。具体操作包括DNA序列的下载、微卫星搜索软件搜索含微卫星的DNA序列、设计引物、在相应物种中进行扩增。这种方法相较上述几种方法更简单方便，但是它只能应用于水稻、拟南芥等序列信息已知的物种，目前该方法主要用于EST-SSR的开发。随着各种生物基因组测序计划的不断开展，生物信息学方法势必将成为一种快速、简便、实用的微卫星开发技术。梅花鹿基因组计划的初步完成，为梅花鹿遗传标记的深度开发带来了机遇。基因组庞大规模序列的可利用性、高通量基因表达检测方法的发展及大规模数据分析能力的提高，为STR位点发现展现了广阔的前景。然而，STR位点的筛选不等于STR位点的应用。目前，STR位点的主要挑战之一，就是要快速估测和了解该位点的应用价值，确定该位点是否能够用于梅花鹿种群遗传结构评价和亲缘关系鉴定研究。STR位点的筛选研究正在成为当今物种遗传资源评价的重要途径，同时也为深入了解梅花鹿现有群体的遗传本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于梅花鹿全基因组开发的STR分子标记，其特征在于，所述STR分子标记为STR1、STR2、STR6、STR8、STR11、STR18、STR19、STR22、STR23、STR34、STR36、STR42、STR43、STR48、STR49、STR50、STR53、STR58、STR69、STR70、STR72、STR74、STR75、STR77、STR80、STR82、STR89、STR94、STR96、STR97、STR98中的任一个；用于扩增上述STR分子标记的引物序列分别如SEQ ID NO:1‑62所示。

【技术特征摘要】
1.基于梅花鹿全基因组开发的STR分子标记，其特征在于，所述STR分子标记为STR1、STR2、STR6、STR8、STR11、STR18、STR19、STR22、STR23、STR34、STR36、STR42、STR43、STR48、STR49、STR50、STR53、STR58、STR69、STR70、STR72、STR74、STR75、STR77、STR80、STR82、STR89、STR94、STR96、STR97、STR98中的任一个；用于扩增上述STR分子标记的引物序列分别如SEQIDNO:1-62所示。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢秀梅，胡鹏飞，徐佳萍，刘华淼，张正义，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22