hsa_circRNA_103096在肝癌的诊断、治疗及预后中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种CircRNA，其序列如SEQ ID NO：1所示；并且进一步公开了检测该CircRNA的RT‑PCR的引物。该CircRNA在肝癌手术前后具有比较明显的表达差异：在肝癌手术前1天的表达量相对于健康对照组极其显著上调，并且在肝移植术后1天、3天、7天有着显著下调的趋势。由于目前用于肝癌的临床辅助诊断技术尚不完善，因此该CircRNA具有作为肝癌相关的生物标志物的潜能。

The application of hsa_circRNA_103096 in HCC diagnosis, treatment and prognosis.

The invention discloses a CircRNA, its sequence is shown as SEQ ID NO:1 and; primer RT PCR detection of the CircRNA further discloses. The CircRNA has obvious differential expression in hepatocellular carcinoma before and after operation in 1 days before the expression of liver cancer relative to the amount of the healthy control group significantly up-regulated, and in liver transplantation after 1 days, 3 days, 7 days has a significant downward trend. Because of the lack of clinical auxiliary diagnostic techniques for HCC, the CircRNA has potential as a biomarker for liver cancer.

【技术实现步骤摘要】
hsa_circRNA_103096在肝癌的诊断、治疗及预后中的应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种新的环状hsa_circRNA_103096的应用。
技术介绍
肝脏是身体内极其重要的代谢器官，其功能的失调会影响机体正常的新陈代谢和内环境的变化。原发性肝癌(PrimaryLiverCancer，PLC)是一类发生于肝脏的恶性肿瘤，一般由化学致癌物或环境因素引发的慢性肝病或肝硬化发展而来，但是目前发病机制还未阐明，病理诊断和治疗手段有一定的局限性。同种异体肝移植是目前治疗PLC最彻底、有效的方法，但如何提高供肝利用率和受者生存率一直也是医疗界所面临的问题。因此，迫切需要发现用于PLC早期诊断以及治疗作用评估的新生物标记物。近年来，随着分子生物学基因芯片技术的发展，越来越多的研究者利用该技术探索了各类生物小分子与疾病的关系，而环状RNA(circularRNA,circRNA)是目前研究重大疾病分子机理的热点。circRNA是一类保守性好、特异性高，对靶基因能发挥调控作用的内源性非编码RNA。因此筛选出具有差异表达的circRNA作为疾病相关的生物标志物，并对其进行功能研究，可以更好地了解疾病发生的分子机制，进而提高相关疾病的预防和诊断水平。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种新的环状RNA的序列及其应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种环状RNA，其序列是如SEQIDNO：1所示。优选的，该环状RNA可以作为肝癌检测、治疗、预后靶点进行应用。一种肝癌检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测序列为SEQIDNO：1的环状RNA的试剂。优选的，该试剂盒中含有实时荧光定量检测序列为SEQIDNO：1的环状RNA的引物序列。进一步优选的，环状RNA引物序列是：F：5’-GGCTACGGGAGGAGAACAAG-3’(SEQIDNO：4)；R：5’-TGCTGGCAATTCAAACACACAT-3’(SEQIDNO：5)。一种肝功能指标检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测序列为SEQIDNO：1的环状RNA的试剂。优选的，该试剂盒中含有实时荧光定量检测序列为SEQIDNO：1的环状RNA的引物序列。进一步优选的，环状RNA引物序列是：F：5’-GGCTACGGGAGGAGAACAAG-3’(SEQIDNO：4)；R：5’-TGCTGGCAATTCAAACACACAT-3’(SEQIDNO：5)。优选的，肝功能指标为谷草转氨酶、谷丙转氨酶中的至少一种。本专利技术的有益效果是：本专利技术申请公开的CircRNA在肝癌手术前后具有比较明显的表达差异，目前用于肝癌的临床辅助诊断技术尚不完善，因此该CircRNA具有作为肝癌相关的生物标志物的潜能。附图说明图1为hsa_circRNA_103096在肝移植术前1天、肝移植术后1天、3天、7天的表达量。具体实施方式以下具体实施例对本专利技术作进一步阐述，但不作为对本专利技术的限定。实施例1在对肝癌进行研究的过程中，发现了一个环状RNA。其序列是：TGGAAGGAGGCAAAACCGGAAGACCTTATGGATTCAAAACTTAGATGTGTGTTTGAATTGCCAGCAGAGAATGATAAACCACATGATGTAGAAATAAATAAAATTATATCCACAACTGCATCAAAGACAGAAACACCAATAGTGTCTAAGTCTCTGAGTTCTTCTTTGGATGACACCGAAGTTAAGAAGGTTATGGAAGAATGTAAGAGGCTGCAAGGTGAAGTTCAGAGGCTACGGGAGGAGAACAAGCAGTTCAAG(SEQIDNO：1)，将其命名为hsa_circRNA_103096。实验例2材料与处理：1)外周血标本的收集标本收取于中国人民解放军第一八一医院肾脏科进行PLC肝移植手术前1天、术后1天、术后3天、术后7天患者，以及于中国人民解放军第一八一医院门诊部门体检正常的健康志愿者的外周血，每个标本收集0.5ml于0.5ml的冻存管中并置于-80℃冰箱保存，储存备用。所有研究对象均知情同意参加本项实验，且该过程经医院伦理委员会审查批准。2)样品的制备与评估RNA样品制备实验分为肝癌病人肝移植术前1天组、术后1天、术后3天、术后7天组和健康对照组。每组取2ml混样全血，用1mLTRIzol试剂和移液管将细胞吹吸裂解液几次，而悬浮细胞则是在离心的沉淀中加入TRIzol试剂并用移液管反复吹吸以裂解细胞，在TRIzol试剂加入前不要洗涤细胞以免增加mRNA降解的可能。为了将核酸蛋白复合体完全解离，把加了TRIzol的样品于15-30℃放置5min；每1mL的TRIzol试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖；手动剧烈振荡管体15s后，15-30℃孵育2-3min；4℃下12,000×g离心15mim；离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相；RNA全部被分配于水相中；水相的体积大约使匀浆时加入的TRIzol试剂的60％。将水相转移到新离心管中；水相与异丙醇混合使其中的RNA沉淀(加入异丙醇的量为每个样品匀浆加入1mLTRIzol试剂时加0.5mL的异丙醇)；混匀后15-30℃孵育10min后，于4℃12,000×g离心10min；RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，每1mLTRIzol试剂匀浆的样品中加入至少75％的乙醇1mL用于清洗RNA沉淀；振荡后，4℃7,500×g离心5min。最后，为了不降低RNA的可溶性，在空气中不完全干燥RNA沉淀5-10min。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55-60℃孵育10min。获得的RNA溶液保存于-70℃。总RNA纯化及质检使用NanoDropND-1000评估RNA量和质量，吸光度在260和280mn处测定，A260/A280的比值需要接近2.0(1.8-2.1之间均可)，并且A260/A230比值要大于1.8。RNA完整性和纯度通过标准变性凝胶电泳进行评估。具体实验过程如下。在微量离心管中分别加入重新溶解的RNA≤85μL、10×反应缓冲液10μL、Baseline-ZERODNA酶5μL、无RNA酶的水至100μL；37℃孵育30min；加入350μL缓冲液RLT，混匀；加入250μL乙醇(96–100％)，吸打混匀；将上述700μL的样品加入到安装在2mL收集管上的RNeasy小型离心柱中，小心地盖上盖子，在≥8000×g的离心机上离心15s，弃去流体；在RNeasy小柱中加入500μL缓冲液RPE(RPE缓冲液第一次使用前，按瓶上所述加入4倍体积的96-100％乙醇配成工作溶液)，小心地盖上盖子≥8000×g离心15s，洗涤RNeasy膜，弃去流体；再次加入500μL缓冲液RPE，盖上盖子，≥8000×g离心2min，洗涤RNeasy膜；把RNeasy柱放在一新的2mL的收集管中，用过滤法去除旧的收集管，全速离心1min；RNeasy柱转移到一新的1.5mL的离心管中，吸取适量无RNA酶的水直接加入到RNeasy膜中；盖上管盖，≥8000×g离心1min，洗脱；最后进行RNA定量和质量控制。实验例3实时荧光定量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环状RNA，其序列是：TGGAAGGAGGCAAAACCGGAAGACCTTATGGATTCAAAACTTAGATGTGTGTTTGAATTGCCAGCAGAGAATGATAAACCACATGATGTAGAAATAAATAAAATTATATCCACAACTGCATCAAAGACAGAAACACCAATAGTGTCTAAGTCTCTGAGTTCTTCTTTGGATGACACCGAAGTTAAGAAGGTTATGGAAGAATGTAAGAGGCTGCAAGGTGAAGTTCAGAGGCTACGGGAGGAGAACAAGCAGTTCAAG(SEQ ID NO：1)。

【技术特征摘要】
1.一种环状RNA，其序列是：TGGAAGGAGGCAAAACCGGAAGACCTTATGGATTCAAAACTTAGATGTGTGTTTGAATTGCCAGCAGAGAATGATAAACCACATGATGTAGAAATAAATAAAATTATATCCACAACTGCATCAAAGACAGAAACACCAATAGTGTCTAAGTCTCTGAGTTCTTCTTTGGATGACACCGAAGTTAAGAAGGTTATGGAAGAATGTAAGAGGCTGCAAGGTGAAGTTCAGAGGCTACGGGAGGAGAACAAGCAGTTCAAG(SEQIDNO：1)。2.权利要求1所述的环状RNA作为肝癌检测、治疗、预后靶点的应用。3.一种肝癌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有能够定量检测权利要求1所述的环状RNA的试剂。4.根据权利要求3所述的肝癌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有实时荧光定量检测权利要求1所述的环状RNA的引物序列。5.根据权利要求4所述的肝癌检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴勇，眭维国，甘晴，张捷，初国海，刘济忠，
申请(专利权)人：深圳市东亿健康服务有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44