对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法和试剂盒技术

提供对样品中相对于野生型形式具有突变的目标核酸序列进行偏向扩增的方法，包括：提供与目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；提供包含样品、封闭序列和根据目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，变性步骤包括：升温至足够高的温度，使封闭序列与样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使封闭序列与目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，第一温度高于引物与模板的退火温度，随后升温至第二温度，第二温度比封闭序列与目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(Tm)低约1-5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的Tm。

Method and kit for biased amplification of target nucleic acid sequences in a sample

To provide samples compared with the wild-type form with target nucleic acid sequence mutation method, including: providing biased amplification of wild-type form and target nucleic acid sequence at least part of a chain of justice and / or complementary antisense strand chain closed sequence, closed sequence contains one or more locked nucleic acid replacement; contains samples, closed sequence and PCR reaction system according to the target sequence design of forward and reverse primers and cyclic amplification reaction, denaturation method comprises the following steps: heating to a high enough temperature, the nucleic acid sequence and contact closed in the sample, then cooled to the first temperature of the closed sequence and the target nucleic acid sequence and wild type target the sequence of formation of duplexes, annealing temperature is higher than the temperature of the first primer and template, and then heated to second temperature and second temperature than the closing sequence and order The melting temperature (Tm) of the double stranded form of the wild form of the tag sequence is about 1-5 degrees lower, and higher than that of the wild form double stranded Tm of the target sequence.

【技术实现步骤摘要】
对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法和试剂盒专利
本申请涉及分子生物学领域。具体而言，本申请涉及对样品中的目标核酸片段进行偏向扩增的方法、试剂盒、系统及其应用。专利技术背景基因突变，特别是点突变，是生物学领域中生理状态或病理状态下的常见现象。因此，对于基因突变的检测在很多领域中具有重要意义。目前，对于检测基因突变，公认的金标准是Sanger测序法。但是，该方法要求样品中突变基因的丰度比较高，通常在20％以上才能够进行检测。因此，对于某些低频突变而言，直接应用测序法存在较大困难或难以实现。因此，基因突变检测方法，特别是对于低频突变的检测方法亟需改进。本申请针对该需求提供了新的用于对核酸样品中的目标片段(特别是样品中的低频突变)进行偏向扩增的方法、试剂盒以及系统，从而为基因突变检测提供了基础。专利技术概述第一方面，本申请提供了用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的方法，目标片段相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述方法包括以下步骤：(1)提供与所述目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；(2)提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法，所述目标核酸序列相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述方法包括以下步骤：(1)提供与所述目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；(2)提供包含所述样品、封闭序列和根据所述目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，其中变性步骤包括：升温至足够高的温度，使所述封闭序列与所述样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使所述封闭序列与所述目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，其中所述第一温度高于所述引物与模板的退火温度，随后升温至第二温度，所述第二温度比...

【技术特征摘要】
1.对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法，所述目标核酸序列相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述方法包括以下步骤：(1)提供与所述目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；(2)提供包含所述样品、封闭序列和根据所述目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，其中变性步骤包括：升温至足够高的温度，使所述封闭序列与所述样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使所述封闭序列与所述目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，其中所述第一温度高于所述引物与模板的退火温度，随后升温至第二温度，所述第二温度比所述封闭序列与所述目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(Tm)低约1-5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的Tm；以及(3)任选地，分离和纯化步骤(2)获得的扩增产物。2.如权利要求1所述的方法，其中所述目标序列包含约40-250个核苷酸。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述封闭序列包含约10％至约100％的锁核酸置换。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述锁核酸置换在所述封闭序列中为基本上均匀地分布。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛猛，王宏伟，
申请(专利权)人：葛猛，北京福安华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11