一种提高m制造技术

本发明专利技术公开一种提高m

A way to improve M

The invention discloses a method for improving M

【技术实现步骤摘要】
一种提高m6A抗体富集甲基化mRNA产量的方法
：本专利技术属于医学生物
，具体涉及一种提高m6A抗体富集甲基化mRNA产量的方法。技术背景：信使RNA(mRNA)是联系DNA与蛋白质的核心分子，其参与的遗传信息传递过程是生命的核心进程。虽然mRNA的修饰在20世纪70年代就已经被发现，但是由于mRNA本身的特性和技术的限制，使得mRNA的修饰研究进展较为缓慢。随着m6A-seq、MeRIP、miCLIP、m1A-seq、m1A-ID-seq、Aza-IP、hMeRIP-seq、ψ-seq、CeU-seq和RiboMeth-seq等一系列技术的产生，转录组范围内mRNA分子的m6A、m1A、m5C、5hmC、假尿嘧啶修饰和2'-O-甲基化等修饰位点信息被揭示。近两年来，mRNA修饰研究出现了井喷式的发展，尤其是m6A(6-甲基腺嘌呤),成为了RNA生物学研究的一个新兴领域。m6A修饰是广泛存在于真核高等生物的RNA上，特别是在mRNA上，该修饰主要存在于mRNA是CDS区的3’-UTR区，特别是终止密码子附近区域，其广泛参与了RNA代谢的各种生物学过程，包括RNA剪接、RNA出核、RNA与蛋白互相作用和RNA降解。哺乳动物体内m6A甲基转移酶复合物中有一部分成分已被解析，主要有METTL3(Me-thyltransferase-likeprotein3)、METTL14(Methyltransferase-likeprotein14)和WTAP(Wilmstumor1-associatingprotein)。m6A去甲基酶肥胖蛋白FTO(Fatmassandobesityassociatedprotein)和ALKBH5(AlkBhomolog5)依赖α-酮戊二酸(α-Ketoglutaricacid,α-KG)和Fe(Ⅱ)对m6A进行氧化去甲基化反应。m6A在生物体内由m6A结合蛋白识别，并介导其行使功能。目前发现的m6A结合蛋白有YTH结构域蛋白YTHDF1(YTHdomain-containingfamilyprotein1)、YTHDF2(YTHdomain-containingfamilyprotein2)、YTHDC1(YTHdomain-containingprotein1)和核内HNRNPA2B1(HeterogeneousnuclearribonucleoproteinsA2B1)。m6A作为一个新颖的RNA表观遗传修饰对于基因表达等基础生命进程发挥着重要作用，包括调控生物节律、减数分裂和胚胎干细胞增殖等。Dominissini等发现，沉默m6A甲基转移酶可以显著影响基因表达水平和选择性剪接模式，从而影响p53信号通路和细胞凋亡。Meyer等发现，m6A修饰呈现组织特异性调控，其在脑的发育过程中会显著增加。此外，他们还发现有67％的3'-UTR存在m6A修饰，而这些3'-UTR同时会有至少一个TargetScan预测的microRNA结合位点，并且这些m6A修饰位点大都在microRNA结合位点的上游。在脑组织的进一步实验显示，那些表达量较高的microRNA的靶标也会有较高的m6A修饰水平，这暗示microRNA水平可能调控着其靶标转录本的m6A水平。Batista等的研究表明，m6A可以促使干细胞从自我更新状态转向细胞分化。2015年，Geula等关于m6A修饰对胚胎干细胞多能性调控作用的研究表明，m6A能够通过影响促多能性基因的mRNA水平与稳定性，对ESCs的多能性进行调控。近几年，m6AmRNA甲基化修饰研究工作取得很大的进展，但仍存在许多挑战。技术的限制是mRNA修饰研究的较大挑战之一。目前，m6A-seq和MeRIP是研究m6ARNA甲基化修饰的重要手段和技术之一。MeRIP-seq技术将甲基化DNA免疫共沉淀技术、RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNAimmunoprecipitation,RIP)技术和RNA测序(RNAsequencing,RNA-seq)技术组合起来，高精度地检测全基因组(或全转录组)范围内的RNA甲基化。MeRIP-seq技术采用免疫共沉淀方法，即甲基化RNA特异性抗体与被随机打断的RNA片段进行孵育，抓取有甲基化修饰的片段进行测序；同时需要平行测序一个对照(control)样本，对照样本用于消除抓取带有甲基化片段过程中的背景。然后将免疫共沉淀(IP)样本和对照样本中的序列片段对比(或定位)到参考基因组/转录组上，检测RNA甲基化位点。对照样本测量对应RNA的表达量，本质上是RNA-seq数据。以m6AmRNA甲基化修饰为例，通过该方法，可检测分析出样品的m6A甲基化位点、峰、差异甲基化、剪接异构体层次上的甲基化位点以及基于分子网络的RNA甲基化功能注释。在m6A-seq的方法步骤中，最为关键的步骤为免疫共沉淀的反应以及免疫共沉淀复合物中mRNA的洗脱。如果在这两个步骤中不成功或者效果不理想，最后抓取获得的甲基化mRNA的含量非常低，甚至不能满足深度测序所需要的含量，从而造成试验的失败。在该方法中，研究者常常采用N6-Methyladenosine,5′-monophosphatesodiumsalt(Sigma-Aldrich,cat.no.M2780)作为洗脱剂，该试剂价格昂贵(4612元)，而且耗时长(3个小时以上)，反应的次数有限(每管仅仅可做10个反应)，最大的问题是该方法洗脱获得的甲基化mRNA的含量非常低，这给后续的深度测序造成了极大的困难。因此，选择一种廉价、快速、高效的洗脱剂对于研究m6AmRNA甲基化修饰具有重要的意义。
技术实现思路
：本专利技术的目的是针对m6A抗体与mRNA免疫共沉淀产量低，价格昂贵的问题，提供一种用于洗脱m6A和甲基化mRNA复合物的洗脱液及其应用，该洗脱液中加入proteasek，采用该洗脱液洗脱m6A和甲基化mRNA复合物获得甲基化mRNA，可以显著降低试验成本，缩短试验时间，提高洗脱效率和mRNA的得率。本专利技术的另一目的在于提供一种提高m6A抗体富集甲基化mRNA产量的方法，该方法采用proteasek等作为洗脱液，并对洗脱液的体积、洗脱时间和温度进行优化，从而提高m6A抗体拉取mRNA的产量，并大大降低试验成本，为m6ARNA甲基化修饰的研究提供经济高效的方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种用于洗脱m6A和甲基化mRNA复合物的洗脱液，其特征在于：该洗脱液包含以下组分：NaCl：0～0.2M；Tris：1～20mM，pH8.0；EDTA：0.5～5mM；SDS：0.01～0.5；proteinasek：1～300μg/mL。优选的，该洗脱液包括以下组分：NaCl：0.01～0.2M；Tris：1～20mM，pH8.0；EDTA：0.5～5mM；SDS：0.01～0.5；proteinasek：10～300μg/mL。更进一步优选的，该洗脱液包含以下组分：NaCl：0.05～0.2M；Tris：5～20mM，pH8.0；EDTA：0.5～5mM；SDS：0.01～0.2；proteinasek：100～300μg/mL。上述的洗脱液在提高m6A抗体富集甲基化mRNA产量中的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于洗脱m

【技术特征摘要】
1.一种用于洗脱m6A和甲基化mRNA复合物的洗脱液，其特征在于：该洗脱液包含以下组分：NaCl：0～0.2M；Tris：1～20mM，pH8.0；EDTA：0.5～5mM；SDS：0.01～0.5；proteinasek：1～300μg/mL。2.根据权利要求1所述的洗脱液，其特征在于：包含以下组分：NaCl：0.05～0.2M；Tris：5～20mM，pH8.0；EDTA：0.5～5mM；SDS：0.01～0.2；proteinasek：100～300μg/mL。3.权利要求1或2所述的洗脱液在提高m6A抗体富集甲基化mRNA产量中的应用。4.一种提高m6A抗体富集甲基化mRNA产量的方法，其特征在于：对制备的m6A和甲基化mRNA的复合物采用洗脱液进行洗脱分离m6A和mRNA，从而获得甲基化mRNA，所述的洗脱液包含以下组分：NaCl：0～0.2M；Tris：1～20mM，pH8.0；EDTA：0.5～5mM；SDS：0.01～0.5；proteinasek：1～30...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟翔，余嘉瑶，李兴美，李毅，王恬，张莉莉，王超，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32