一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法，在特定疾病的单拷贝待测基因以外，引入另一个单拷贝基因作为参比基因，在理想情况下，待测基因和参比基因的两种荧光信号的拷贝数比值应为1:1，然而实际扩增中，引物、探针等因素引起的基因间扩增效率的不同引起芯片微孔内的拷贝数不一致，进而导致了上述拷贝数比值为偏离A且偏离了1:1，本发明专利技术构建了与疾病待测基因和参比基因序列均高度相似的载体作为内参，待测基因和参比基因中载体的拷贝数的比值理论值为1:1，实际扩增出现了偏离B，多次实验确定了偏离A基本等于偏离B，可通过分别求得待测基因和参比基因的各模板的拷贝数比值来消除偏离，提高了数字PCR检测的准确性。

A method of digital correction based on PCR amplification detection

The invention discloses a method for detecting digital correction based on PCR amplification, copy in specific disease of single gene to be tested outside, into a single copy gene as a reference gene, in the ideal case, the measured gene and reference gene copy two fluorescent signal number ratio should be 1:1, however the actual amplification primers and probes, caused by factors such as gene amplification efficiency caused by different chip within the pores of the copy number is not the same, which leads to the deviation of A and the copy number ratio is deviated from the 1:1, the invention constructs a vector and disease detected gene and reference gene sequences were highly similar as control. The measured ratio of reference gene and gene copy number in the theory of vector value is 1:1, the actual amplification has deviated from B, many experiments to determine the deviation of A is substantially equal to the deviation of B, can get measured based respectively. Because of the ratio of copy number of each template of reference gene, the deviation was eliminated, and the accuracy of digital PCR detection was improved.

【技术实现步骤摘要】
一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法
本专利技术属于PCR检测领域，具体涉及一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法。
技术介绍
数字PCR即DigitalPCR(dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术，数字PCR技术是一种新型分子诊断技术，具有高灵敏度、高准确性、绝对定量等特点。芯片法数字PCR和普通PCR相比，特殊性在于数字PCR的反应体系被分配到芯片上的微孔内，理论上每个微孔中只含一个DNA模板片段，并在扩增结束后才对每个微孔进行荧光信号检测。基于该特殊性，当数字PCR的扩增效率较低时，某些微孔内的模板在初期循环中延伸失败，使得模板实际循环数少于理论循环数，导致最终的荧光信号成指数型降低，在芯片上体现出最终结果的偏差。该偏差降低了基于数字PCR技术的高精密度诊断试剂盒的检测灵敏度，甚至会出现漏检或假阴性结果。本专利通过在PCR反应体系中加入人工合成的矫正质粒来校正这种结果偏差，对于推广数字PCR技术、提高临床诊断准确率有着深远的意义。
技术实现思路
如上所述，为了克服因不同基因和引物之间扩增效率不同带来的数字PCR结果偏差，本专利技术提供了一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法，可以减本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法，其特征在于，所述方法通过如下步骤实现：(1)提取待检测者的全血基因组作为血样本模板，然后确定血样本模板的一个单拷贝基因作为待测基因，再确定血样本模板的另一个单拷贝基因作为参比基因，制备两个相同且等量的第一血样本模板和第二血样本模板；(2)设计合成包含待测基因和参比基因的序列作为载体模板，且载体模板上的待测基因数量等于参比基因的数量，制备两个相同且等量的第一载体模板和第二载体模板；(3)配置含有第一血样本模板的第一数字PCR反应混合液分散至第一芯片的微反应孔中，第一数字PCR反应混合液包括2×Mix、待测基因引物、第一血样本模板及对应的探针、水、第一载体模板...

【技术特征摘要】
1.一种基于扩增矫正的数字PCR检测方法，其特征在于，所述方法通过如下步骤实现：(1)提取待检测者的全血基因组作为血样本模板，然后确定血样本模板的一个单拷贝基因作为待测基因，再确定血样本模板的另一个单拷贝基因作为参比基因，制备两个相同且等量的第一血样本模板和第二血样本模板；(2)设计合成包含待测基因和参比基因的序列作为载体模板，且载体模板上的待测基因数量等于参比基因的数量，制备两个相同且等量的第一载体模板和第二载体模板；(3)配置含有第一血样本模板的第一数字PCR反应混合液分散至第一芯片的微反应孔中，第一数字PCR反应混合液包括2×Mix、待测基因引物、第一血样本模板及对应的探针、水、第一载体模板及对应的探针；(4)配置含有第二血样本模板的第二数字PCR反应混合液分散至第二芯片的微反应孔中作为内参，第二数字PCR反应混合液包括2×Mix、参比基因引物、第二血样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹恺，罗海贝，
申请(专利权)人：华东医药杭州基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33