递送Survivin‑siRNA的GO‑R8/RGDV的制备、活性和应用制造技术

本发明专利技术公开了递送Survivin‑siRNA的递送体系GO‑R8/RGDV/Survivin‑siRNA，公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它转染Survivin‑siRNA的效率，公开了它沉默Survivin基因的作用，公开了它抑制肿瘤细胞增殖的作用，进一步公开了它靶向性抑制S180小鼠肿瘤生长的作用，进而公开了它在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。

Preparation, activity and application delivery of Survivin siRNA GO R8/RGDV

The invention discloses siRNA delivery system for delivery of Survivin GO R8/RGDV/Survivin siRNA, discloses the preparation method and discloses its nano structures, it discloses the efficiency of transfection of Survivin siRNA, unveiled its Survivin gene silencing effect, discloses its inhibitory effect on proliferation of cancer cells, further discloses it targeted inhibition of tumor growth in S180 mice, and then open it by application of tumor gene therapy in the system.

【技术实现步骤摘要】
递送Survivin-siRNA的GO-R8/RGDV的制备、活性和应用
本专利技术涉及递送Survivin-siRNA的递送体系GO-R8/RGDV/Survivin-siRNA，涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它转染Survivin-siRNA的效率，涉及它沉默Survivin基因的作用，涉及它抑制肿瘤细胞增殖的作用，进一步涉及它靶向性抑制S180小鼠肿瘤生长的作用，进而公开了它在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。属于生物医药学领域。
技术介绍
肿瘤细胞的增殖与凋亡调节失衡是肿瘤发生和发展的主要因素之一，凋亡抑制蛋白(IAP)家族在抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂方面具有重要的作用。而Survivin蛋白作为IAP家族中相对分子质量最小的一个，其在多种肿瘤组织或细胞中普遍表达，而在大多数分化成熟的正常成人组织中未见表达。作为目前发现的效应最强的凋亡抑制基因，其具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，在细胞周期和血管形成等多方面都扮演重要的角色，因此可作为肿瘤靶向治疗的有效靶点。基因治疗发展到今天已经由最初的用于单基因遗传性疾病的治疗扩大到恶性肿瘤、代谢性疾病、感染性疾病等重大疾病的治疗。而RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近年来研究最多、前景最广泛的基因治疗手段之一，该方法能够通过沉默或者下调肿瘤细胞中抗凋亡基因或蛋白的表达，从而促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长。利用RNA干扰技术，将Survivin-siRNA递送到肿瘤细胞中，将能够有效抑制Survivin基因的表达。而由于裸露的siRNA在组织或者细胞中容易被核酶降解，大大降低其基因沉默的效率；裸露的基因也没有靶向能力，不能够靶向进入肿瘤细胞导致其基因沉默效率的降低；而且基因表面带有负电荷，与细胞膜表面所带电荷相同，会导致细胞内吞和内涵体逃逸变得困难这些缺陷导致必须要有一种理想的siRNA递送体系将siRNA安全、高效、靶向地递送至癌细胞。石墨烯作为一种新型单层碳原子组成的二维碳纳米材料，由于氧化石墨烯(GO)极大的比表面积和良好的生物相容性，以及活性基团较多，容易修饰等特性，其在基因转运、药物输送等领域具有极大的应用前景。细胞穿膜肽是一种能够介导外源性物质进入细胞的短肽，其种类繁多，其中八聚精氨酸具有最强的穿膜能力，选择八聚精氨酸作为纳米载药体系的修饰成分，能够增加载体的生物相容性，提高转染效率，且易于降解，降解产物为可被人体利用的精氨酸。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽，其能够特异性地结合肿瘤细胞或者新生血管表达的整合素。在基因治疗领域，RGD肽及其衍生物修饰的基因纳米载体都显示出更高的基因转染效率。综合以上理论基础，本专利以氧化石墨烯为载体，在对其进行羧基化处理后，将R8和RGDV四肽依次分别共价修饰到其表面，并对所得到的纳米载体GO-R8/RGDV载Survivin抗肿瘤治疗的各项性能进行了评价。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种含有Survivin-siRNA的载药系统，由抗肿瘤基因治疗药物Survivin-siRNA和靶向递送载体GO-R8/RGDV制备而成。其中,所述靶向递送载体GO-R8/RGDV由以下组分制备而成：GO、R8、RGDV。其中,所述靶向递送载体GO-R8/RGDV的制备方法如下：GO表面羧基化之后依次连接R8和RGDV。本专利技术所述的载药系统GO-R8/RGDV/Survivin-siRNA，为纳米结构。本专利技术的第二个目的在于提供载药系统GO-R8/RGDV/Survivin-siRNA的制备方法。本专利技术所述的载药系统的制备方法，包括以下步骤：1)制备靶向递送载体GO-R8/RGDV，方法如下：制备羧基化的GO，羧基化的GO和R8制备成GO-R8，用GO-R8和RGDV制备GO-R8/RGDV；2)制备GO-R8/RGDV/Survivin-siRNA，方法如下：GO-R8/RGDV和Survivin-siRNA混合制备得到GO-R8/RGDV/Survivin-siRNA。本专利技术所述的制备方法，其中所述制备靶向递送载体GO-R8/RGDV，方法如下：1)制备羧基化的氧化石墨烯GO-COOH(1)称取GO粉末于茄瓶中，加入三蒸水，超声使完全溶解，(2)称取氢氧化钠固体于小烧杯中，加入三蒸水，搅拌使完全溶解，待冷却后加入氯乙酸钠，搅拌使充分溶解，(3)将混合液(2)加入(1)中，充分混合，在磁力搅拌器下常温搅拌，反应4h，然后超声1h，之后继续在磁力搅拌器下反应1h，结束反应，(4)将反应液离心，弃上清，沉淀加入三蒸水溶解，以盐酸调节pH至中性，(5)最后得到的沉淀以三蒸水溶解，用透析袋透析以除去残留的无机离子，最终得到GO羧基化的产物：GO-COOH，2)制备GO-R8(1)称取GO-COOH粉末溶于二甲基甲酰胺中，使完全溶解，加入EDC和HOBt，继续超声使GO-COOH活化，最后加入精确称取的R8，在磁力搅拌器下搅拌过夜，(2)将反应液离心，弃上清，以三蒸水复溶，重复离心，最后一次离心后用三蒸水溶解沉淀，用透析袋透析处理，3)合成RGDV(1)合成Boc-Arg(NO2)-Gly-OH：称取Boc-Arg(NO2)-OH溶于干燥DMF中，冰浴条件下依次加入DCC和HOBt，磁力搅拌器下搅拌以活化羧基，然后缓慢加入NH2-Gly-OBzl，用NMM调节pH至8-9，搅拌，反应过夜，以TLC监测直至Boc-Arg(NO2)-OH的反应点消失，结束反应，(2)将反应液减压抽滤，所得滤液于旋转蒸发仪上除去溶剂，加入适量乙酸乙酯溶解，对所得溶液进行十八洗，最后将得到的溶液用无水Na2SO4干燥半个小时，于旋转蒸发仪上除尽溶剂乙酸乙酯，得到粉末状Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl，(3)将所得产物溶于甲醇，冰浴条件下滴加浓度为2N的NaOH至pH12-14，磁力搅拌器下搅拌反应，TLC监测反应点由TLC板中部消失并在起始位置出现，表明反应完全，结束反应，以饱和KHSO4调节pH至7，于旋转蒸发仪上除去大部分溶剂，再调节pH至3-5，以乙酸乙酯萃取，再用饱和NaCl洗涤，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，除尽溶剂，得到脱掉-OBzl裸露-COOH的Boc-Arg(NO2)-Gly-OH850mg，产率为76％，(4)合成NH2-Asp(OBzl)-Val-OBzl：依照上一步骤进行接肽反应，分别投料Boc-Asp(OBzl)-OH和H-Val-OBzl，最终得到Boc-Asp(OBzl)-Val(OBzl)，(5)将所得产物用干燥乙酸乙酯溶解，滴加浓度为4N的HCl/EA，装上干燥管，磁力搅拌器下搅拌，以TLC监测反应，至反应点消失表明反应完全，结束反应，用水泵抽除EA，再用干燥EA溶解，再次抽干，重复3次后，用乙醚溶解并抽干，重复3次，即得到脱掉Boc-保护基的NH2-Asp(OBzl)-Val-OBzl，(6)合成Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl：将(1)、(2)两步所得到的产物依照以上步骤进行接肽反应，分别投料Boc-Arg(NO2)-Gly-OH和NH2-Asp(OBzl)-Val-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有Survivin‑siRNA的载药系统，其特征在于，由抗肿瘤基因治疗药物Survivin‑siRNA和靶向递送载体GO‑R8/RGDV制备而成。

【技术特征摘要】
1.一种含有Survivin-siRNA的载药系统，其特征在于，由抗肿瘤基因治疗药物Survivin-siRNA和靶向递送载体GO-R8/RGDV制备而成。2.权利要求1所述的载药系统，其特征在于，其中所述靶向递送载体GO-R8/RGDV由以下组分制备而成：GO、R8、RGDV。3.权利要求2所述的载药系统，其特征在于，其中所述靶向递送载体GO-R8/RGDV的制备方法如下：GO表面羧基化之后依次连接R8和RGDV。4.权利要求1所述的载药系统，其特征在于，为纳米结构。5.权利要求1所述的载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备靶向递送载体GO-R8/RGDV，方法如下：制备羧基化的GO，羧基化的GO和R8制备成GO-R8，用GO-R8和RGDV制备GO-R8/RGDV；2)制备GO-R8/RGDV/Survivin-siRNA，方法如下：GO-R8/RGDV和Survivin-siRNA混合制备得到GO-R8/RGDV/Survivin-siRNA。6.权利要求5所述的制备方法，其中所述制备靶向递送载体GO-R8/RGDV，方法如下：1)制备羧基化的氧化石墨烯GO-COOH(1)称取GO粉末于茄瓶中，加入三蒸水，超声使完全溶解，(2)称取氢氧化钠固体于小烧杯中，加入三蒸水，搅拌使完全溶解，待冷却后加入氯乙酸钠，搅拌使充分溶解，(3)将混合液(2)加入(1)中，充分混合，在磁力搅拌器下常温搅拌，反应4h，然后超声1h，之后继续在磁力搅拌器下反应1h，结束反应，(4)将反应液离心，弃上清，沉淀加入三蒸水溶解，以盐酸调节pH至中性，(5)最后得到的沉淀以三蒸水溶解，用透析袋透析以除去残留的无机离子，最终得到GO羧基化的产物：GO-COOH，2)制备GO-R8(1)称取GO-COOH粉末溶于二甲基甲酰胺中，使完全溶解，加入EDC和HOBt，继续超声使GO-COOH活化，最后加入精确称取的R8，在磁力搅拌器下搅拌过夜，(2)将反应液离心，弃上清，以三蒸水复溶，重复离心，最后一次离心后用三蒸水溶解沉淀，用透析袋透析处理，3)合成RGDV(1)合成Boc-Arg(NO2)-Gly-OH：称取Boc-Arg(NO2)-OH溶于干燥DMF中，冰浴条件下依次加入DCC和HOBt，磁力搅拌器下搅拌以活化羧基，然后缓慢加入NH2-Gly-OBzl，用NMM调节pH至8-9，搅拌，反应过夜，以TLC监测直至Boc-Arg(NO2)-OH的反应点消失，结束反应，(2)将反应液减压抽滤，所得滤液于旋转蒸发仪上除去溶剂，加入适量乙酸乙酯溶解，对所得溶液进行十八洗，最后将得到的溶液用无水Na2SO4干燥半个小时，于旋转蒸发仪上除尽溶剂乙酸乙酯，得到粉末状Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl，(3)将所得产物溶于甲醇，冰浴条件下滴加浓度为2N的NaOH至pH12-14，磁力搅拌器下搅拌反应，TLC监测反应点由TLC板中部消失并在起始位置出现，表明反应完全，结束反应，以饱和KHSO4调节pH至7，于旋转蒸发仪上除去大部分溶剂，再调节pH至3-5，以乙酸乙酯萃取，再用饱和NaCl洗涤，最后用无水Na2SO4干燥，过滤，除尽溶剂，得到脱掉-OBzl裸露-COOH的Boc-Arg(NO2)-Gly-OH850mg，产率为76％，(4)合成NH2-Asp(OBzl)-Val-OBzl：依照上一步骤进行接肽反应，分别投料Boc-Asp(OBzl)-OH和H-Val-OBzl，最终得到Boc-Asp(OBzl)-Val(OBzl)，(5)将所得产物用干燥乙酸乙酯溶解，滴加浓度为4N的HCl/EA，装上干燥管，磁力搅拌器下搅拌，以TLC监测反应，至反应点消失表明反应完全，结束反应，用水泵抽除EA，再用干燥EA溶解，再次抽干，重复3次后，用乙醚溶解并抽干，重复3次，即得到脱掉Boc-保护基的NH2-Asp(OBzl)-Val-OBzl，(6)合成Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl：将(1)、(2)两步所得到的产物依照以上步骤进行接肽反应，分别投料Boc-Arg(NO2)-Gly-OH和NH2-Asp(OBzl)-Val-OBzl，得到Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，4)制备GO-R8/RGDV(1)将上一步得到的Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl以NaOH脱保护得到Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OH)-Val-OH后，将其溶解于蒸馏水中，(2)将GO-R8溶于DMF中，超声使充分分散，(3)将(2)加入(1)，常温下用磁力搅拌器搅拌，反应，(4)反应结束后，将反应液离心，弃置上清液，以三蒸水复溶，重复离心，最后一次离心后用三蒸水溶解沉淀，透析袋透析处理后，冷冻干燥得到GO-R8/Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OH)-Val-OH，(5)将(4)中得到的GO-R8/Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OH)-Val-OH粉末溶于强酸溶液中，搅拌反应，脱去四肽上的所有保护基，反应结束后离心，用乙醚重复离心，然后再以三蒸水重复离心，收集沉淀，冷冻干燥，得到GO-...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔纯莹，戈旭，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11