一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒，包括能检测人体肝特异的试剂，所述试剂包含在APOA5基因甲基化位点肝特异区序列的引物。所述引物的核苷酸序列为以下序列中的一种或多种：APOA5‑M‑F、APOA5‑M‑R、APOA5‑U‑F、APOA5‑U‑R。本发明专利技术是根据高通量测序的实验结果分析出特异性的肝甲基化位点，进行肝癌的检测，特别适用于早期和复发。

A kit for detection of liver cancer based on DNA methylation and its application

The invention relates to a kit for detecting liver cancer based on DNA methylation, which comprises a reagent capable of detecting human liver specific, including the primers in the liver specific region sequence of the methylated site of the APOA5 gene. The nucleotide sequences of the primers for one or more of the following sequence: APOA5 F, APOA5 M M R, APOA5 F, APOA5 U U R. The present invention is based on the results of high-throughput sequencing experiments to analyze specific methylated sites of the liver and to detect liver cancer, especially for early and recurrent liver cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒及应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒及应用。
技术介绍
DNA甲基化发生在5'-胞嘧啶位置，主要处于5'-CG-3'核苷酸模式中，通过将S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，并在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下，以活性甲基取代CpG二核苷酸中的胞嘧啶环上5'位置的氢，从而转变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。甲基胞嘧啶是对哺乳动物基因组DNA唯一的一种化学修饰。作为最重要的表观遗传机制，它在一个新水平揭示了基因组多样性，即：不同组织不同细胞的基因表达，在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段有不同的甲基化水平。基因组DNA上各CpG位点甲基化状态的差异构成基因组DNA甲基化谱。由于DNA甲基化模式形成过程中呈现的异质性以及组织特异性差异甲基化区域(tissuespecificdifferentiallymethylatedregions，tDMRs)的发现，DNA甲基化也开始被逐渐应用在法医学的相关领域。比如在某些基因座，所有组织体细胞都选择性地将亲代一方的等位基因甲基化，呈现亲源依赖的等位基因甲基化模式。亲源特异性甲基化在细胞世代间的传递。在病理情况下，组织细胞的DNA甲基谱发生特异性的改变。DNA甲基化改变在许多肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用，可望用于肿瘤早期诊断和类型甚至亚型的区分，例如胃癌、肺癌、前列腺癌症。DNA甲基化检测方法飞速发展，高通量测序技术、芯片技术进行全基因组甲基化检测，定量的甲基化质谱检测技术越老越多的技术应用于甲基化研究。随着分子生物学技术特别是高通量测序技术的发展，研究人员从几个位点甲基化到系统地研究甲基化。本专利是根据高通量测序的实验结果分析出特异性的肝甲基化位点，进行肝癌的检测，特别适用于早期和复发。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含能检测人体肝特异的试剂。人体有一肝特异的甲基化位点，通过检测，可对肝癌患者进行监测，特别是肝癌早起和肝癌复发患者。所述试剂包含在APOA5基因甲基化位点肝特异区序列的引物。所述引物的核苷酸序列为以下序列中的一种或多种：APOA5-M-F、APOA5-M-R、APOA5-U-F、APOA5-U-R。所述引物具体如下：APOA5-M-F：TTTATGGGGTAAATTATTATTTTACGTAPOA5-M-R：CCTAAAAACTTCACTTACAAATTTCCGAPOA5-U-F：TTTTTTTTATGGAGGTAAATTTTATTATTTAPOA5-U-R：TAAAAACTTCATCTACAAATTCCTACA。本专利技术进一步提出地，所述试剂盒还包括APOA5基因甲基化转化试剂和甲基化保护试剂；所述甲基化保护试剂与所述甲基化转化试剂的使用比例为1:5～6；优选地，所述甲基化保护试剂可选用EZDNAMethylation-GoldKit(ZYMORESEARCH)、EpiTectFastDNABisulfiteKite(QIAGEN)中的一种；优选地，所述甲基化转化试剂可选用CTConversionReagent(CatNo.D5001-1)(ZYMORESEARCH),、BisulfiteSolution(LotNo.154016700)或DNAProtectBuffer(LotNo.154024444,QIAGEN)中的一种；本专利技术进一步提出地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTP及缓冲液；其中，所述DNA聚合酶、所述引物、所述dNTP、所述缓冲液的体积比例为0.2～0.3:4:3～6:4～6。所述DNA聚合酶可选用TaKaRaExTaq。本专利技术进一步提出地，所述引物APOA5-M-F、APOA5-M-R、APOA5-U-F、APOA5-U-R等体积混合。本专利技术的第二个目的在于，权利要求1-4所述的试剂盒在血液检测中的应用；具体地，在检测人体APOA5基因是否是肝癌样本的应用。所述检测的步骤包括：提取待检测者血液中游离DNA，进行DNA甲基化转化；将甲基化DNA用所述引物进行PCR扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图；判断待检测者是否是肝癌样本。所述检测的方法还包括：采集身体正常的检测者的血液，提取血液中游离DNA，进行DNA甲基化转化；将甲基化DNA用所述引物进行PCR扩增反应，经过电泳，制得正常人琼脂糖胶胶图；采集待检测者的血液，制得琼脂糖胶胶图，与所述正常人琼脂糖胶胶图比较。其中，所述提取待检测者血液中游离DNA的具体步骤为：提取待检测者血液中游离DNA，进行DNA甲基化转化；将甲基化DNA用所述引物进行PCR扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图。进一步具体为：采集待检测者外周静脉血，用抗凝管在4℃下保存，采集血液两个小内，在4℃下进行离心，1600转/分钟，离心10分钟，取上清液。将获得的上清液进行第二次离心，在4℃下，16000转/分钟，离心10分钟，取上清液。使用DNA提取试剂提取游离DNA，溶于50μl水。然后用Qubit2.0(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)用HSAssayKit精确定量。本专利技术优选DNA提取试剂为QIAGEN(Cat.55114)。本专利技术进一步提出地，所述甲基化转化的反应条件为：在DNA提取液内添加DNA甲基化保护剂，DNA甲基化转化剂，所述甲基化保护剂与所述甲基化转化剂的使用比例为1:5～6，优化为3:17。DNA甲基化转化后还需要进一步进行清洗处理；本专利技术进一提出地，所述PCR扩增反应的体系包括引物APOA5-M-F、引物APOA5-M-R及DNA聚合酶；所述引物APOA5-M-F、所述引物APOA5-M-R与所述甲基化DNA的添加比例为1:1:3～5。本专利技术利用软件自行设计引物，经过预实验扩增结果筛选并调整扩增条件，优化反应体系，最终使用优化后的条件进行sybr荧光定量实验；本专利技术进行DNA甲基化转化及PCR扩增反应会根据实际使用的试剂不同，反应程序和试剂用量会有所区别。DNA甲基化转化后还需要进行清洗处理也会根据清洗的试剂用量和步骤会有所不同。本专利技术作为优先方案，一种血液检测具体步骤为：1)用抗凝管采集外周静脉血，首先以1000～2000转/分钟的转速离心后取出上清液，再以10000～20000转/分钟的转速离心，取上清液，使用DNA提取试剂提取游离DNA，溶于水中，得DNA提取液；所述DNA提取试剂为QIAGEN(55114)；2)在DNA提取液中加入DNA甲基化保护剂，使用DNA甲基化试剂对游离DNA进行甲基化转化；所述DNA甲基化保护剂与所述DNA甲基化转化剂的体积比例为3:17；DNA甲基化转后后，将甲基化DNA进行清洗。3)将甲基化DNA用所述引物和DNA聚合酶进行PCR扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图；其中所述DNA聚合酶与所述引物的体积比例为1:15。本专利技术是根据高通量测序的实验结果分析出特异性的肝甲基化位点，进行肝癌的检测，特别适用于早期和复发。本方法操作简单，检测准确较高。附图说明图1为实施例1中琼脂糖胶鉴定扩增产物的糖胶图；图2为实施例2中琼脂糖胶鉴定扩增产物的糖胶图；图3为实施例3的荧光定量扩增曲线图；图4为实施例4的荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒，其特征在于，包括能检测人体肝特异的试剂，所述试剂包含在APOA5基因甲基化位点肝特异区序列的引物。

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒，其特征在于，包括能检测人体肝特异的试剂，所述试剂包含在APOA5基因甲基化位点肝特异区序列的引物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为以下序列中的一种或多种：APOA5-M-F、APOA5-M-R、APOA5-U-F、APOA5-U-R。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括APOA5基因甲基化转化试剂和甲基化保护试剂、DNA聚合酶；所述甲基化保护试剂与所述甲基化转化试剂的体积比例为1:5～6。4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTP及缓冲液；其中，所述DNA聚合酶、所述引物、所述dNTP、所述缓冲液的体积比例为0.2～0.3:4:3～6:4～6。5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述引物APOA5-M-F、APOA5-M-R、APOA5-U-F、APOA5-U-R等体积混合。6.权利要求1-5所述的试剂盒在血液检测中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测的方法包括以下步骤：提取待检测者血液中游离DNA，进行DNA甲基化转化；将甲基化DNA用所述引物进行PCR扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱嘉林，刘文丽，武会娟，张小莉，田彦捷，方晨，刘旭，
申请(专利权)人：北京市理化分析测试中心，
类型：发明
国别省市：北京,11