热休克蛋白70在诊断预防治疗胶质瘤中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物制药领域，设计热休克蛋白70胶质瘤相关肿瘤疫苗，具体涉及热休克蛋白70作为与预后相关的恶性胶质瘤特异性肿瘤抗原，和所述抗原诱导巨噬细胞反应用于临床预后判定，及其在制备恶性胶质瘤免疫治疗疫苗中的用途。本发明专利技术通过免疫组化的方法，证实热休克蛋白70在胶质瘤微环境中高表达；同时验证了HSP70表达量与临床预后的相关性，本发明专利技术的热休克蛋白70胶质瘤相关肿瘤抗原可进一步制备包含该抗原的组合物和化合物及制备免疫治疗的制剂，用于判定恶性胶质瘤预后和免疫治疗。

【技术实现步骤摘要】
热休克蛋白70在诊断预防治疗胶质瘤中的应用
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及热休克蛋白70在诊断预防治疗胶质瘤中的应用。
技术介绍
胶质瘤(Glioma)是中枢神经系统(CNS)中最为常见的肿瘤之一，2010年WHO的统计数据显示，胶质瘤约占中枢神经系统肿瘤发病率的45％以上。尽管现代医学科学技术的飞速发展，人们对脑胶质瘤病因及发病机制的深入研究，使本病的诊断和治疗取得了很大的进步。但是脑胶质瘤的最终预后并未有根本性改观，患者在诊断后往往仅有一年左右的生存时间。而导致胶质瘤易复发、高死亡率主要有两方面的因素：一是胶质瘤内高度增生的血管网，为胶质瘤的增殖提供了充足养分，并介导了胶质瘤的侵袭；另一个则是胶质瘤高度的侵袭性和复发性。因此，对该疾病发生、发展中的相关机制仍需要进行更深入的研究。肿瘤疫苗正在成为肿瘤生物治疗的一种重要手段，越来越得到了人们广泛重视，研制开发疗效好、应用范围广的肿瘤疫苗已成为目前肿瘤防治研究的一个热点问题。肿瘤疫苗抗肿瘤作用的机理主要依赖于其中的肿瘤抗原，尤其是肿瘤特异性抗原发挥了重要作用。肿瘤抗原进入体内后通过抗原递呈激活机体免疫系统，诱导机体产生针对肿瘤的特异性细胞进而杀伤肿瘤细胞。热休克蛋白(HeatShockProteins，HSPs)是生物体(或离体培养的细胞)在不良环境因素作用下产生的具有高度保守性的应激蛋白，普遍存在于整个生物界。热休克蛋白按分子量大小分为以下几个家族：热休克HSP(相对分子质量为22～32kDa)、HSP60、HSP70、HSP90、HSP100和泛素(相对分子质量为7～8kDa)，其中最重要、诱导后表达量最大的是HSP70家族。HSP70是热休克蛋白家族中最重要的成员之一，它具有分子伴侣功能，参与蛋白质合成、加工、折叠、转运等过程。它在肿瘤细胞特别是在恶性肿瘤细胞中常有高水平表达，可以通过基因调解以及免疫应答来发挥抗肿瘤细胞凋亡作用。由此，HSP70与肿瘤的发生发展、肿瘤免疫、肿瘤治疗中耐药性和肿瘤的预后等都有密切关系，在恶性肿瘤的发生发展过程中有重要作用。明确HSP70的调控机制以及作用过程，有利于肿瘤发病机制的阐明，并为肿瘤的诊治提供更充分的理论依据。然而，关于HSP70的临床应用还未见报道。我们将HSP70设计为治疗肿瘤的靶点，并以此为脑胶质瘤治疗设计新的抗癌药物。
技术实现思路
本专利技术提供热休克蛋白HSP70用于抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭的应用；给予某种肿瘤相关性的抗原蛋白与过表达的热休克蛋白HSP70，制备成脑胶质瘤的靶向抑制剂，用于胶质瘤的免疫治疗。本专利技术提出的热休克蛋白70在制备产品中的应用，所述产品的功能具有如下(1)至(6)中至少一种：(1)抑制胶质瘤细胞增殖；(2)促进胶质瘤细胞凋亡；(3)抑制胶质瘤生长；(4)抑制胶质瘤侵袭；(5)抑制胶质瘤转移；(6)治疗和/或预防胶质瘤。优选地，所述热休克蛋白70的获得方式为D1)或D2)：D1)体外合成；D2)将编码所述热休克蛋白70的核酸分子导入受体中进行表达。优选地，所述产品为药物。本专利技术还提出的一种产品，其活性成分为热休克蛋白70；所述产品的功能具有如下(1)至(6)中至少一种：(1)抑制胶质瘤细胞增殖；(2)促进胶质瘤细胞凋亡；(3)抑制胶质瘤生长；(4)抑制胶质瘤侵袭；(5)抑制胶质瘤转移；(6)治疗和/或预防胶质瘤。优选地，所述热休克蛋白70的获得方式为D1)或D2)：D1)体外合成；D2)将编码所述热休克蛋白70的核酸分子导入受体中进行表达。优选地，所述产品为药物。本专利技术涉及的热休克HSP70合成蛋白具有抑制胶质瘤细胞增殖、促进胶质瘤细胞凋亡、抑制胶质瘤生长、抑制胶质瘤侵袭、抑制胶质瘤转移、治疗和/或预防胶质瘤的功能。本专利技术对于脑胶质瘤的治疗具有重大价值，可用于抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭；给予某种肿瘤相关性的抗原蛋白与过表达的热休克蛋白HSP70，制备成脑胶质瘤的靶向抑制剂，用于脑胶质瘤的免疫治疗。附图说明图1为具有代表性的患者胶质瘤组织HSP70免疫组化切片。图2为图1统计分析结果的柱状图。图3为图3为具有代表性的WHOⅣ级的患者胶质瘤组织HSP70、GFAP、IBA-1和CD45免疫荧光的结果图。图4为第14天对照组的代表性的T1、T2和HSP70组的MRI图像。图5为图4统计分析结果的柱状图。图6为第21天对照组的代表性的T1、T2和HSP70组的MRI图像。图7为图6统计分析结果的柱状图。图8为Westernblot观察HSP70过表达与空载转染的GL261细胞中HSP70的表达量图。图9为RT-PCR观察HSP70过表达与空载转染的GL261细胞中HSP70的表达水平图。图10为Transwell体系观察HSP70过表达与空载转染的GL261细胞迁移能力图。图11为图10统计分析结果的柱状图。图12为Transwell体系观察HSP70过表达与空载转染的GL261细胞与巨噬细胞共培养后迁移能力图。图13为图12统计分析结果的柱状图。图14为第14天对照组的代表性的T1、T2和HSP70过表达组的MRI图像。图15为图14统计分析结果的柱状图。图16为第21天对照组的代表性的T1、T2和HSP70过表达组的MRI图像。图17为图16统计分析结果的柱状图。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1热休克蛋白70(HSP70)的表达水平与患者胶质瘤恶性程度呈正相关为了解释热休克蛋白70(HSP70)与胶质母细胞瘤恶性程度的关系，申请人利用免疫组化的方法在三种临床病理分级的病人脑胶质瘤组织切片(WHOⅡ-Ⅳ)利用免疫组化标记HSP70的表达水平，如图1所示，图1为具有代表性的患者胶质瘤组织HSP70免疫组化切片，其中褐色标记的为HSP70阳性的组织，放大倍数为10×；对图1中HSP70阳性的组织进行统计，其结果如图2所示，其中n＝21，**P<0.01，*P<0.05。从图1和图2可以发现HSP70在脑胶质瘤中表达水平明显增高，而且与胶质瘤恶性程度密切相关，不同级别之间存在显著性差异。随后我们分别用红色荧光标记HSP70，绿色荧光的GFAP、Iba-1和CD45分别标记胶质瘤细胞、小胶质细胞以及血源性细胞。如图3所示，图3为具有代表性的WHOⅣ级的患者胶质瘤组织HSP70、GFAP、IBA-1和CD45免疫荧光的结果，放大倍数为10×；由图3发现HSP70主要表达于组织中的胶质瘤细胞，在间质细胞中上也有少量表达。以上结果说明热休克蛋白70(HSP70)在胶质瘤组织中广泛表达，HSP70的表达水平与患者胶质瘤恶性程度呈正相关，并且HSP70主要来源于胶质瘤细胞和间质中的巨噬细胞。实施例2瘤内注射热休克蛋白70(HSP70)能够在体抑制小鼠胶质瘤的生长研究结果表明，外源性的热休克蛋白70(HSP70)参与了脑胶质瘤的发展过程。针对HSP70如何影响胶质瘤的进程的问题，申请人构建原位小鼠脑胶质瘤模型，采用瘤内注射HSP70的方法观察肿瘤的体积。实验按照以本文档来自技高网...

【技术保护点】
热休克蛋白70在制备产品中的应用，所述产品的功能具有如下(1)至(6)中至少一种：(1)抑制胶质瘤细胞增殖；(2)促进胶质瘤细胞凋亡；(3)抑制胶质瘤生长；(4)抑制胶质瘤侵袭；(5)抑制胶质瘤转移；(6)治疗和/或预防胶质瘤。

【技术特征摘要】
1.热休克蛋白70在制备产品中的应用，所述产品的功能具有如下(1)至(6)中至少一种：(1)抑制胶质瘤细胞增殖；(2)促进胶质瘤细胞凋亡；(3)抑制胶质瘤生长；(4)抑制胶质瘤侵袭；(5)抑制胶质瘤转移；(6)治疗和/或预防胶质瘤。2.根据权利要求1所述热休克蛋白70在制备产品中的应用，其特征在于，所述热休克蛋白70的获得方式为D1)或D2)：D1)体外合成；D2)将编码所述热休克蛋白70的核酸分子导入受体中进行表达。3.根据权利要求1或2所述热休克蛋白70在制备产品中的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：严斌，张瀚文，王思雨，王燕，朱琳琳，
申请(专利权)人：南京医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32